优化分子结构：Affibody-ABD035融合蛋白靶向CEACAM5的肿瘤蓄积取决于结构域顺序

《International Journal of Biological Macromolecules》：Tumour accumulation of anti-carcinoembryonic antigen affibody-albumin-binding domain fusion depends on domains' order

为了解决传统抗体靶向药物在实体瘤中穿透性差、血液滞留时间长导致的骨髓损伤等问题，研究人员开展了一项关于靶向癌胚抗原相关细胞黏附分子5（CEACAM5）的Affibody融合蛋白研究。他们设计并评估了两种将延长血液半衰期的白蛋白结合结构域（ABD035）与CEACAM5靶向的Affibody二聚体（C9-C9）进行融合的蛋白变体。研究发现，融合显著降低了肾脏摄取，并极大地增加了血液浓度和肿瘤靶向性，且ABD035位于N端的变体（[99mTc]Tc-ABD035-C9-C9）显示出更优的药代动力学和肿瘤蓄积效果。此项工作为开发靶向CEACAM5表达恶性肿瘤的、基于工程支架蛋白的新型靶向治疗平台提供了重要依据。

　　

靶向治疗是癌症治疗领域极具前景的策略，其核心在于利用能特异性识别肿瘤异常表达的分子（即靶点）的“导航”工具，将细胞毒性药物或放射性核素精准送达肿瘤。癌胚抗原相关细胞黏附分子5（Carcinoembryonic antigen adhesion molecule 5, CEACAM5，旧称CEA）是一个备受关注的“全癌抗原”靶点。它在多种癌症中高表达，但在正常组织中表达有限，是理想的靶向目标。传统上，靶向CEACAM5的研究多基于抗体，但抗体分子大、肿瘤穿透慢、血液清除慢，容易导致不必要的全身照射和骨髓毒性。那么，有没有一种“身材”更小巧、能更快进入肿瘤、同时又能长时间“待命”以提高打击效率的“新武器”呢？

工程支架蛋白，特别是Affibody分子，为解决这一问题带来了新思路。Affibody是一种小型的、由58个氨基酸组成的蛋白，可以通过工程化改造获得对特定靶点（如CEACAM5）的高亲和力和高特异性。它们分子量小，能够快速进入肿瘤，也容易从血液和非靶组织中清除，这是其优点。但“成也萧何，败也萧何”，过快的血液清除也减少了其到达肿瘤的机会和时间。为此，科学家们想出了一个巧妙的“搭车”策略：将Affibody与一个能够强力结合血液中丰度极高的血清白蛋白的结构域（Albumin Binding Domain, ABD）融合。这样一来，Affibody就像搭上了血液循环系统中的“长途巴士”，其半衰期得以大幅延长，从而有更多机会“巡游”全身并发现肿瘤目标。本研究的核心团队，包括Eleftherios Papalanis、Ruonan Li、Maryam Oroujeni等多位研究者，在《International Journal of Biological Macromolecules》上发表的研究，正是对这一策略的系统性探索和优化。

然而，简单的“拼装”未必能达到最佳效果。在之前对其他工程支架蛋白（如DARPins和ADAPTs）的研究中，研究人员发现，ABD在融合蛋白中的位置（是放在靶向结构域的“前面”还是“后面”）会显著影响其在体内的分布和靶向效果。于是，本研究提出了一个关键的科学问题：对于靶向CEACAM5的Affibody二聚体C9-C9，与ABD₀₃₅（一种经过亲和力成熟的ABD变体）融合时，其融合顺序是否会影响其靶向效率？为了回答这个问题，他们设计并制造了两种分子“构型”：一种是ABD₀₃₅位于N端的ABD₀₃₅-C9-C9，另一种是ABD₀₃₅位于C端的C9-C9-ABD₀₃₅。此外，他们还制备了不融合ABD₀₃₅的C9-C9作为对照，以及用无靶向能力的C0结构域替换C9的对照蛋白，以验证特异性。

为了精确追踪这些蛋白在体外的结合能力和在体内的“旅行轨迹”，研究者采用了放射性核素^99mTc进行标记。他们在两种融合蛋白的C末端引入了一个特异的EYEC氨基酸序列，这个短肽就像一个“小口袋”，可以稳定地“抓住”^99mTc，从而实现位点特异性标记，确保放射性标签不会干扰蛋白的正常功能。利用这种“发光”标记，研究者可以对蛋白进行定量分析。整个研究的核心技术方法可概括为：1) 蛋白工程设计与表达：通过基因工程手段设计并利用大肠杆菌（E. coli）系统表达两种ABD₀₃₅融合蛋白变体及其对照蛋白。2) 蛋白质表征与亲和力测定：通过表面等离子体共振（SPR）等技术，验证蛋白的纯度、结构正确性，并精确测量其对CEACAM5以及人和鼠血清白蛋白的亲和力。3) 放射性核素标记：使用^99mTc对蛋白进行位点特异性标记，用于后续的体内外示踪。4) 体外细胞实验：在表达不同水平CEACAM5的人源肿瘤细胞系（BxPC3高表达，LS174T中表达，HT-29几乎不表达）上进行特异性结合、竞争抑制、动力学和内存化实验。5) 体内动物模型研究：在携带上述三种人源肿瘤细胞系异种移植瘤的裸鼠模型中，通过离体生物分布实验和SPECT/CT成像，系统比较不同时间点（4、24、48小时）下，两种融合蛋白及对照蛋白在血液、肿瘤及各正常器官中的摄取和分布情况，评估其靶向性、药代动力学和治疗潜力。

研究人员首先验证了他们的设计是否成功。3.1. Production and characterisation of CEACAM5-targeting affibody molecules 部分显示，所有蛋白都被成功纯化，并且结构正确、高度纯化，具有高α螺旋含量，熔解温度约为54°C，且加热变性后能完全复性，表明它们结构稳定。3.2. Interaction of the affibody with CEACAM-5, HSA, and MSA 部分通过SPR分析证实，两种融合蛋白对CEACAM5的亲和力都很高，表观解离常数K_D都在低纳摩尔范围（1.1 nM 和 1.8 nM），与未融合ABD₀₃₅的C9-C9相近。同时，它们对人和鼠血清白蛋白也表现出强的纳摩尔级结合力。这表明ABD₀₃₅的融合没有损害C9-C9的靶向能力，并且赋予了其结合白蛋白的能力。

在体外细胞实验中（3.4. Binding of C9-C9-based agents to cells in vitro is saturable, proportional to CEACAM5 expression, and depends on the presence of human serum albumin），研究结果非常明确。放射性标记的两种融合蛋白能够特异性地结合到表达CEACAM5的BxPC3和LS174T细胞上，而这种结合可以被过量的非标记蛋白竞争掉。更重要的是，结合水平与细胞表面CEACAM5的表达量成正比，在几乎不表达CEACAM5的HT-29细胞上结合极低。一个有趣的发现是，在培养基中加入人血清白蛋白（HSA）后，ABD₀₃₅-C9-C9（N端融合）对细胞的结合显著增加，而C9-C9-ABD₀₃₅（C端融合）则没有明显变化。这提示，在N端融合的构型中，ABD₀₃₅与白蛋白的结合可能以一种特殊的方式“解放”或优化了C9-C9的靶向结构域，使其更容易结合靶点。035-C9-C9的结合显著增加。">

最核心的体内实验结果在3.5. Fusion with ABD₀₃₅dramatically decreases the renal uptake, but increases retention of C9-C9 in blood and its accumulation in tumours 和 3.6. Biodistribution of ABD₀₃₅-fused C9-C9 depends on the order of albumin-binding and targeting domains in a construct 两部分揭示。与未融合ABD₀₃₅的C9-C9相比，融合后产生了“一降两升”的戏剧性变化：肾脏摄取降低了10倍，血液浓度增加了50倍以上，而肿瘤摄取增加了6倍。这完美实现了设计的初衷——通过“搭车”延长血液停留时间，从而增加肿瘤暴露机会，同时大幅减少经肾脏快速排泄导致的肾毒性风险。035融合对C9-C9生物分布的影响。与未融合的C9-C9相比，融合后肾脏摄取显著降低，而血液和肿瘤摄取大幅增加。">

然而，故事的高潮在于两种融合构型之间的差异。注射后4小时，两者的血液浓度和肿瘤摄取几乎相同。但随着时间推移，差异逐渐显现。ABD₀₃₅-C9-C9在血液中的半衰期（T_?= 20.6小时）显著长于C9-C9-ABD₀₃₅（T_?= 12.3小时）。相应地，在注射后24小时和48小时，ABD₀₃₅-C9-C9在肿瘤中的蓄积量显著高于C9-C9-ABD₀₃₅，并且在48小时时，其在几乎所有正常器官中的残留也更高。这表明，N端融合的构型具有更长的系统循环时间，从而为肿瘤持续累积药物提供了更长的“时间窗口”。SPECT/CT成像也直观地证实了这一点，ABD₀₃₅-C9-C9在肿瘤中的信号更强。035-C9-C9的肿瘤摄取信号更强。">

研究的严谨性还体现在3.7. The tumour uptake of ABD₀₃₅-fused C9-C9 is CEACAM5-specific and depends on the expression level of CEACAM5 in the tumours 部分。通过使用无靶向能力的C0对照蛋白，研究者证实了肿瘤摄取的特异性：C9融合蛋白在肿瘤中的高摄取完全依赖于其对CEACAM5的结合能力。同时，在不同CEACAM5表达水平的三种肿瘤模型中，肿瘤摄取量与靶点表达水平严格正相关，这进一步证明了其靶向的有效性和精确性。

在4. Discussion和5. Conclusion部分，作者对上述结果进行了深入分析和总结。他们指出，ABD₀₃₅的融合极大地优化了C9-C9的药代动力学，使其从一个快速经肾清除、肿瘤蓄积有限的成像探针，转变为一个具有长血液半衰期和高肿瘤靶向效率的潜在治疗载体。研究最关键的发现是，分子架构的优化——即ABD₀₃₅在融合蛋白中的位置——对其功能有决定性影响。ABD₀₃₅位于N端的变体（ABD₀₃₅-C9-C9）表现更优。作者推测，这种差异可能源于两种构型与血清白蛋白结合的解离动力学不同。C端融合的蛋白（C9-C9-ABD₀₃₅）与白蛋白的解离速率更快，在血液流经肾脏的短暂瞬间，解离的分子更容易被肾脏过滤清除，从而整体上缩短了其血液循环时间。此外，体外实验中观察到的、在HSA存在下ABD₀₃₅-C9-C9结合力增强的现象也提示，N端融合可能减少了两个结构域之间的相互干扰，当ABD结合白蛋白后，反而可能促进靶向结构域与CEACAM5的结合。

这项研究的意义重大。首先，它成功构建并验证了一个基于Affibody-ABD融合的、靶向CEACAM5的高效肿瘤靶向平台。这个平台结合了小分子蛋白的快速组织穿透优势和“白蛋白搭车”策略的长循环优势。其次，它强调了在开发多功能融合蛋白时，精细的分子设计（如结构域顺序）的重要性，这不能仅凭经验预测，必须通过实验（尤其是体内实验）来筛选和验证。最后，ABD₀₃₅-C9-C9被确立为一个极具前景的先导分子，为后续搭载细胞毒性药物（如拓扑异构酶I抑制剂或微管蛋白抑制剂）或治疗性放射性核素，开发用于治疗结直肠癌、胰腺癌、卵巢癌等多种CEACAM5阳性恶性肿瘤的新型靶向疗法奠定了坚实的基础。这项研究不仅推进了特定靶点的药物研发，也为整个工程支架蛋白在肿瘤靶向治疗领域的应用优化提供了宝贵的范式参考。