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真菌感染快速诊断新方法：基于旋转小麦须状石墨烯微电极的脉冲电裂解技术实现97%以上真菌裂解率（45秒），结合多重PCR检测使真菌诊断灵敏度达100%、特异性96.9%，为重症监护等场景提供快速样本前处理方案。
傅全英|龚凯业|冯少雄|罗晓琪|杨路腾|叶梓|潘聚峰|冯圆圆|王家思|陈培松|周建华
广东省传感技术与生物医学仪器重点实验室，中山大学深圳校区生物医学工程学院，中国深圳518107
摘要
全球每年有超过200万人受到肺部真菌感染的影响，其中80%的死亡率可以通过及时诊断和治疗来降低。核酸检测是识别致病真菌的主要方法。然而，由于真菌细胞壁厚且坚韧，现有方法难以裂解真菌，这阻碍了在重症监护室等关键场景中的快速核酸检测。为了解决这一挑战，我们提出了一种使用旋转式仿小麦芒刺石墨烯微电极（WSG）柱的电解方法，实现了对致病真菌的超快裂解（在36伏电压下仅需45秒）。仿小麦芒刺结构增强了微电极的局部电场强度，使得在较低电压下也能实现不可逆的电穿孔。结合多重聚合酶链反应技术，该方法能够以10^3 CFU/mL的浓度检测到致病真菌，灵敏度达到100%，特异性达到96.9%。此外，该方法也可用于细菌和其他细胞微生物的裂解。本研究不仅探讨了真菌电穿孔的机制，还为裂解真菌和细菌等细胞微生物提供了新的预处理平台，具有广泛的应用前景。
引言
肺部真菌感染是由如曲霉菌、肺孢子菌和新型隐球菌等真菌引起的支气管肺疾病。全球每年有超过200万患者受到影响，死亡率高达80% [1]，[2]，尤其是在免疫功能低下的个体中 [3]，[4]。及时诊断和治疗可以将感染患者的死亡率降低60%–90% [5]，[6]。相反，诊断延迟会增加死亡风险。诊断每延迟24小时，平均住院时间延长1.28天，治疗成本增加约4% [7]，[8]。因此，快速准确的肺部真菌感染诊断对于改善临床结果和降低死亡率至关重要。
在真菌的临床诊断中，基于直接显微镜观察和培养的方法仍然是广泛应用的主要手段。特别是微生物培养被认为是金标准，因为它可以提供可用于物种鉴定和抗真菌敏感性测试的活菌分离株。然而，随着分子诊断技术的发展，核酸检测已成为另一种主要的致病真菌检测方法，因为其具有高灵敏度和特异性 [9]，[10]，[11]。最近的核酸检测技术进步进一步促进了真菌诊断的临床应用。例如，Gu等人 [12] 使用宏基因组下一代测序（mNGS）在6小时内检测到了临床样本中的曲霉菌。Youngquist等人 [13] 结合逆转录-聚合酶链反应（PCR）和CRISPR技术在32份支气管肺泡灌洗液样本中在2小时内检测到了肺孢子菌，灵敏度达到93.3%，特异性达到100%。然而，这些核酸检测的第一步——核酸提取仍然需要复杂的处理过程。这是由于真菌细胞壁厚度达到100–200纳米，并具有很高的机械强度和化学抗性 [14]，[15]，[16]。基于机械研磨结合化学裂解的临床常用提取方法繁琐（涉及4–6个步骤）且耗时（超过1.5小时）[17]，[18]。在重症监护室（ICUs）或发热诊所等时间敏感的临床环境中，需要快速简便地检测致病真菌。为此，开发一种新型高效的真菌核酸释放方法以实现后续的快速检测至关重要。
在这里，我们提出了一种使用旋转式仿小麦芒刺石墨烯微电极（WSG）柱的电解方法，用于快速裂解和检测与肺部感染相关的致病真菌。电穿孔技术 [19] 通过施加电场理论上可以高效快速地释放核酸 [20]。如图1所示，WSG柱具有仿生结构，能够在电穿孔过程中产生高局部电场，增强细胞壁和膜间的跨膜电位差。这使得在较低电压下就能达到破坏病原体所需的跨膜电位阈值。基于旋转式WSG柱，我们开发了一种自动电解装置。在该装置中，旋转的WSG柱浸入含有真菌悬浮液的样品管中，然后在36伏的低直流电压下旋转45秒，以实现多种病原体的超快裂解，裂解率超过97%。随后使用多重实时PCR方法检测曲霉菌、肺孢子菌和新型隐球菌的特异性核酸序列，从而快速识别这些肺部真菌。该方法为真菌和细菌等微生物的裂解提供了快速、高效和准确的解决方案，在肺部感染的临床诊断中具有广泛应用前景。
试剂和仪器
用于制备石墨烯微电极的聚酰亚胺薄膜购自英仕达塑料材料有限公司。用于制造WSG柱的聚碳酸酯圆柱形基底购自优泰科有限公司（中国）。用于活细胞/死细胞染色的SYTO 9和碘化丙啶（PI）染料购自赛默飞世尔科技（美国）。用于检测曲霉菌、肺孢子菌和新型隐球菌的PCR试剂盒购自北京
WSG柱结构表征及其电场分布模拟
图2A显示了本研究中制备的WSG柱。WSG柱由一个高度为35.0毫米、直径为10.0毫米的聚碳酸酯圆柱形基底及其表面集成的WSG组成（图2B(i)）。WSG通过激光直写技术制备（图S1），电极的交错指状结构均匀排列。电极宽度为200微米，间距为70微米，厚度为30微米。通过调整激光的写入路径，可以实现
结论
在这项工作中，我们提出了一种基于旋转式WSG柱的真菌电解方法。通过仿生刺状结构增强局部电场，我们实现了对引起肺部感染的致病真菌的有效裂解（裂解率超过97%，在45秒内），并快速释放核酸。电极的刺状结构使局部电场强度增加到20.4 kV/cm，比无刺状结构的电极高出4.5倍
作者贡献声明
傅全英：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、可视化、方法学、研究、概念化。龚凯业：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、可视化、验证、方法学、研究、形式分析。冯少雄：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、验证、方法学、形式分析。罗晓琪：资源、方法学。杨路腾：软件、研究。叶梓：软件。潘聚峰：资源，
致谢
本工作得到了深圳市科技计划（编号：JCYJ20220818102014028、JCYJ20230807111120043）、广州市科技项目（编号：2024A04J5195）、广州市重点研发计划（编号：202206010089）、国家自然科学基金（编号：22174167、62205382、62201624、32171192、92269106）、国家重点研发计划（编号：2023YFF0714400、2021YFF0703300）以及广东省基础与应用等的财政支持
