综述：从小活检和细胞学标本进行RNA测序的分析前最佳实践

《Molecular Diagnosis & Therapy》：Pre-analytical Best Practices for RNA Sequencing from Small Biopsies and Cytologic Specimens

这篇综述针对临床和研究中的精准肿瘤学需求，系统地梳理了从小活检、细针穿刺、脱落细胞学等微创标本开展RNA测序（RNA-seq）分析前的全流程最佳实践。文章强调了分析前因素（如样本采集、处理、储存等）对RNA质量和测序结果可靠性的重要影响，针对微创标本因体积小、RNA产量有限、工作流程特殊带来的挑战，提出了评估样本充分性、优化RNA质量、最大化肿瘤含量、减少降解的策略，为临床诊断和转化研究提供了增强RNA测序可重复性与标准化的实用框架。

　　

在精准肿瘤学领域，RNA测序（RNA-seq）正日益成为转录组分析、基因融合检测和生物标志物发现的核心工具。通过对小活检、细针穿刺（FNA）和脱落细胞学等微创手术获取的标本进行RNA测序，研究者能够分析那些难以获取或需要纵向取样的癌症的基因表达模式和RNA水平变化。然而，分析前因素（例如样本采集细节、处理和储存工作流程）不仅影响RNA测序的成功率，也影响测序结果的质量和准确性，进而可能影响患者护理和研究进展。微创标本因其体积小、RNA产量有限以及独特的工作流程，带来了一系列独特的分析前挑战。

记录生物样本数据和录入申请

准确和标准化的记录对于减少分析前变异、确保RNA测序数据的可靠性至关重要。必要的元数据包括患者人口统计学信息（如年龄、性别、诊断）以及关于样本获取的详细信息（如活检类型、麻醉使用、标记程序等）。记录还应包括热缺血和冷缺血时间、稳定方法、储存条件以及样本处理和运输的具体情况。一致地收集这些信息有助于提高质量控制和不同研究之间的可比性。生物样本报告改进研究质量清单和标准化分析前代码为应收集的数据类型提供了全面的指导。

生物样本类型与应用

小活检和FNA过去主要用于诊断和肿瘤亚型分型，但如今越来越多地以获取分子谱分析材料为主要目的。癌症治疗早期整合生物标志物检测，减少了对通常难以获得的大手术切除标本的依赖，微创采样方法现已常规用于支持诊断评估以及预测性或预后性生物标志物分析。

小活检

小活检通常指使用粗针（如14-18号核心活检针）或其他技术（如穿刺活检、冷冻活检）采集的组织样本。有证据表明，根据手术类型、肿瘤类型和处理条件，核心针活检的RNA产量和质量有时甚至优于较大切除标本获得的RNA。活检标本在下一代测序（NGS）成功率、RNA产量和完整性方面的差异通常受到所取核心数量、同轴针系统的使用、肿瘤取样的技术挑战以及内在组织特征（如细胞构成、肿瘤基质比、肿瘤活性和血管分布）和外部因素（如室温下的冷缺血时间）的影响。

为了优化RNA保存和下游测序应用，小活检标本的厚度理想情况下不应超过4-5毫米，以确保固定剂或保存剂快速均匀地渗透。此外，对于小活检标本，可以将单个片段分布在多个蜡块中，以最大限度地减少组织消耗并优化样本保存。福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）后处理也会影响RNA指标。有研究报告称，FFPE蜡卷的RNA质量优于从组织切片获得的RNA。新切的FFPE切片应立即处理，理想情况是在24小时内；但有证据表明，切片在室温下（例如23-25 °C）可保持可接受的RNA质量长达90天。

细胞病理学标本

细胞病理学标本，包括通过FNA、脱落细胞学甚至上清液获得的标本，是RNA测序的有价值但历史上未充分利用的资源。其微创性质和临床诊断中的常规应用，使其在手术标本不可用或不足时特别适合分子应用。

细针穿刺

细针穿刺使用细针（20-31号）从浅表或深部病变取样。虽然核心活检保留了病变的结构背景，这对于某些组织学诊断至关重要，但FNA通过最大限度地减少基质污染，通常产生更高的肿瘤细胞构成和纯度，使其在肿瘤分子检测中特别有价值，因为肿瘤细胞富集可以提高检测灵敏度。在评估骨病变时，FNA可以补充或在某些情况下替代核心活检，提供无需脱钙的诊断材料，从而保持核酸质量。据报道，FNA产生的测序指标与核心针活检相当甚至更优。FNA标本在用于转录组分析的RNA测序中表现出强大可靠的性能。

脱落和液基细胞学标本

脱落性生物样本包括通过自发脱落或机械收集（例如通过刷取或刮取）从体液（如积液、尿液、脑脊液、囊肿液或灌洗液）中获得的细胞。这些样本通常是非侵入性的，通常可获得较大体积，并且可以使用各种方法保存。液基细胞学和类似的载玻片制备通常能很好地保持RNA完整性，特别是当使用醇基固定剂时，并且允许制作具有均匀细胞分布的多张载玻片。

恶性积液和其他脱落细胞学标本适合用于靶向和全转录组RNA测序，从细胞沉淀、直接涂片和液基制备物中成功提取和测序已有报道。值得注意的是，一些研究表明，即使在没有RNA稳定保存剂的情况下，这些标本在长时间冷藏后仍能保持足够的RNA质量用于转录组分析。这种韧性，特别是储存为冷藏细胞沉淀的样本，突显了其在分子谱分析工作流程中的潜在效用，尤其是在无法立即处理的情况下。

上清液

上清液——FNA或脱落性标本（例如FNA冲洗液、积液、囊肿液、尿液、脑脊液或活检收集液）离心后剩余的液体部分——在常规病理学工作流程中通常被丢弃。然而，这些液体可能含有具有临床意义的诊断材料，包括细胞游离核酸和细胞外囊泡，代表了一种有价值但未充分利用的分子检测资源，包括RNA测序。细胞学样本来源的上清液为分子谱分析提供了一种补充选择，特别是在组织或细胞成分产生的RNA不足以进行检测，或血浆液体活检因低cfRNA而受限时。然而，由于其不稳定性，与cfDNA相比，cfRNA分析需要更严格的分析前控制和保存策略，以确保分析可靠性和可重复性。

用于RNA分析的组织样本采集

缺血时间

分析前采集间隔会影响RNA完整性。热缺血时间是指组织在采集前血流减少或无血流供应下仍处于体温的时间，而冷缺血时间是组织移除后到保存前的时间段，在此期间样本保持低温或室温但不稳定。组织缺血导致RNA降解，引起片段化和基因表达改变，从而通过丢失低丰度转录本、引入转录组偏倚以及偏向可变剪接模式降低数据质量。缺血诱导的应激反应会激活与炎症、细胞凋亡和缺氧相关的基因，进一步扭曲原始体内状态的转录组，使下游分析和数据解释复杂化。

目前，专家意见和共识指南建议立即处理或保存组织标本，最佳缺血时间小于20分钟到1小时。据报道，在4 °C储存少于24-48小时或在25 °C储存少于0.5-2小时的组织中，RNA测序质量得以保持，而更长的冷缺血时间会降低RNA完整性和测序结果。在湿冰上储存标本可以延迟冷缺血诱导的RNA降解。尽管关于固定延迟何时开始影响RNA质量的研究存在差异，但影响高度可变，并取决于样本类型、细胞构成、保存方法和组织采集技术等因素。RNA质量指标，包括RNA完整性数值，通常随着冷缺血时间延长而下降。针对冷缺血时间的RNA测序特异性研究在文中有总结表格。

脱落性生物样本的构成高度可变，目前尚无普遍接受的关于其缺血时间或固定延迟的指南。然而，通常建议实验室及时处理积液样本或将其在4 °C储存直至处理。虽然关于脱落性生物样本延迟固定对RNA完整性影响的数据有限，但有研究表明，在没有保存剂的情况下冷藏时，细胞形态、免疫反应性和核酸（包括RNA）完整性可以保持数天至数周的稳定。

样本处理与保存

在无法立即分析生物样本的情况下，选择合适的保存方法至关重要。常见的组织制备方法包括RNAlater^?技术、福尔马林固定、硝化纤维素印迹的冷冻、有或无最佳切割温度化合物（OCT）的速冻。虽然通过RNAlater^?或速冻保存标本可能因RNA稳定性更优而更适合RNA测序分析，但当预计需要评估其他分析物时，替代保存方法（如FFPE、OCT和硝化纤维素印迹）可能更合适。虽然钙化组织在测序前可能需要额外处理，但脱钙与RNA产量呈负相关，并显著降低NGS成功率。应避免使用强酸脱钙，因为它们会增加RNA降解。必要时，当预期进行核酸分析时，对于小骨活检，螯合剂（如基于EDTA的脱钙剂）是首选。

速冻

在液氮（LN₂）或液氮气相（VPLN）中速冻（快速冷冻）被广泛认为是保存组织标本中RNA的金标准。为了保持RNA测序分析的最佳RNA完整性，新鲜组织应立即处理，理想情况下在切除后0.5-2小时内通过解剖成小片段并冷冻。理想的RNA测序样本速冻方法确保组织在-53至-93 °C之间快速均匀冻结，从而最大限度地减少RNase蛋白活性。虽然将组织直接浸入LN₂速冻是最冷的选择，但其快速冷却速率可能导致冰晶形成，并且LN₂的低沸点在其遇到环境温度的组织标本时会形成绝缘蒸汽屏障，导致样本外围和核心冻结不均匀，从而影响其形态完整性。在VPLN中速冻组织可最大限度地减少细胞内冰晶形成，从而限制组织的机械破坏，同时抑制RNase介导的RNA降解。在VPLN中有效速冻，直径≤0.4厘米的标本应置于低温样本储存容器中，密封严实，并快速冷冻。替代方法包括如果无法获得LN₂，可浸入LN₂或在干冰上冷冻；然而，除非与OCT等冷冻保护剂结合使用，否则不鼓励将这些方法用于形态学分析的标本。异戊烷通常用于防止假象形成；然而，与使用其他方法冷冻的标本相比，浸入预冷异戊烷中速冻的标本表现出较低的RNA质量和RNA测序性能。在LN₂中-196 °C速冻或使用可调节冷槽温度的电子设备在-73 °C速冻的标本（癌细胞系和正常肝活检）获得了相当的RNA完整性数值和无法区分的RNA测序基因表达谱。此外，在干冰冷却的异戊烷中速冻，或在-80 °C使用冷却剂冷冻设备冷冻的配对肿瘤标本，表现出相当的RNA产量、完整性和RNA测序质量控制参数。因此，只要冷冻温度在-70 °C或以下，RNA测序分析可能对由不同速冻速率和温度引入的微小差异不敏感。

在冷冻前将组织包埋在OCT化合物中在临床实践中很常见，可用于保存组织形态和RNA完整性。OCT是一种水溶性二醇和树脂基质，在冷冻切片过程中提供结构支持，并通过在冷冻过程中最大限度地减少冰晶形成而充当冷冻保护剂。为了确保均匀冷却并降低开裂风险，包埋在OCT中的组织通常使用VPLN、预冷异戊烷或其他快速冷冻方法速冻。值得注意的是，甲醇、乙醇或丙酮不适合替代异戊烷，因为OCT与这些溶剂之间的相互作用会阻止在-20 °C下正常冷冻。OCT包埋对于易受机械损伤的脆弱组织特别有用，能保持与标准速冻相当的RNA完整性。在RNA提取前去除多余的OCT至关重要，因为残留的化合物可能会干扰下游分子技术。如果处理得当，新鲜冷冻的组织可以持续产生高质量的RNA。速冻组织产生的RNA质量显著更高，并支持比FFPE制备标本更稳健可靠的下游基因表达分析。