《Neurology Neuroimmunology & Neuroinflammation》：Development of a Diagnostic Autoantibody Assay to a Consensus Motif for the Risk Prediction of Epstein-Barr Virus–Related Multiple Sclerosis
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本综述研究报道了一种针对多发性硬化症（MS）预测性自身抗体基序P-(SA)-x-(SGA)-R-(SN)-(LRKH)的诊断性检测方法的开发。研究者从一名MS患者的记忆B细胞中克隆出一种高亲和力、广泛交叉反应的单克隆抗体（mAb），并利用其验证和优化了一个基于共识肽的Luminex xMAP血清学检测。该检测在MS队列中显示约10%的阳性率，能提前数年预测MS，并将爱泼斯坦-巴尔病毒（EBV）被膜蛋白BRRF2鉴定为一个关键的耐受打破抗原，与中枢神经系统（CNS）中的波形蛋白（vimentin）存在交叉反应。这项工作为开发支持MS早期诊断、前驱期研究和干预的联合预测风险评分提供了重要工具。
背景与目标
多发性硬化症是一种慢性、进展性的中枢神经系统脱髓鞘性自身免疫疾病。针对基序P-(SA)-x-(SGA)-R-(SN)-(LRKH)的自身抗体是MS特异的一类预测性标志物。本研究的目的是从MS患者的记忆B细胞中鉴定针对该基序的单克隆抗体，开发原理验证性的自身抗体检测方法，以报告血清阳性率、在疾病早期预测MS，并确定在爱泼斯坦-巴尔病毒和中枢神经系统中潜在的耐受打破抗原。
方法
研究使用了包含该基序的肽四聚体，在Beacon光流控系统上筛选从一名MS患者收集的活化记忆B细胞。随后克隆了针对该基序的单克隆抗体，并利用来自临床诊断为MS的患者和健康对照者的血清样本，对Luminex xMAP自身抗体血清学检测进行了验证。抗原发现方法包括噬菌体免疫沉淀测序、生物层干涉技术、人类蛋白质微阵列、等电聚焦凝胶和印迹，以及小鼠脑细胞培养物的免疫荧光染色。
结果
从MS患者记忆B细胞克隆出的单克隆抗体能以2到25纳摩尔不等的亲和力结合多种含有MS特征基序的肽段。通过丙氨酸扫描PhIP-Seq定义的共识肽被用于开发自身免疫性IgG检测，其灵敏度相当于0.5纳克/毫升的单克隆抗体，精密度小于11%，在179名MS患者队列中的阳性率为11%（91名健康对照和49名无关神经系统疾病血清样本为阴性）。利用国防部血清库中的回顾性、纵向样本，证明了该检测对前驱期MS的应用价值。该单克隆抗体以纳摩尔级亲和力将EBV被膜蛋白BRRF2鉴定为耐受打破抗原，该蛋白含有该基序，并与来自MS特征阳性患者的脑脊液中寡克隆区带发生反应。对混合小鼠神经元细胞的免疫细胞化学染色显示，主要交叉反应的人体抗原是波形蛋白。
讨论
本研究报告了一种可用于支持MS诊断、前驱期研究和早期干预的MS特征自身抗体检测方法。将该检测与其他新兴生物标志物整合，将推动联合预测性MS风险评分的发展。
MS特征在MS中的血清学流行率
为了量化807名患者的EPIC队列中对MS特征基序血清阳性的MS患者流行率，使用了先前发表的多重Luminex微珠检测。使用2个或更多肽段阳性的标准，测得的血清阳性率为8.9%。如果没有单个肽段可被单独用于简化检测或提高对MS相对于健康对照的特异性，则采用多重检测。
针对MS特征的单克隆抗体的发现与表征
从一名对多重检测中9个肽段中的8个有反应的血清阳性MS患者体内，通过Beacon系统筛选，鉴定出两个分泌IgG、能与BRRF2、RIMS2和SRSF4荧光肽四聚体交叉反应的B细胞。B细胞受体测序确定它们完全相同，为IgG3kappa同种型。重组单克隆抗体在抗原选择性方面显示出等效的结合力。MS特征单克隆抗体对一组包含基序的肽段的亲和力范围为2至25纳摩尔。EBV BRRF2或gM肽段的不同结构模型可能影响表位呈现和结合。MS特征单克隆抗体对EBV BRRF2（约1纳摩尔）或gM（约6纳摩尔）的动力学结合进行了比较。MS特征基序中保守的脯氨酸和精氨酸残基的丙氨酸取代废除了结合。
MS特征基序共识肽的鉴定
对在多重检测中具有2-9个血清阳性肽段的MS患者血清样本进行了丙氨酸扫描或终止扫描肽段噬菌体文库的富集测试。根据这些结果构建的平均热图证实，结合仅集中在预期的基序P-(SA)-x-(SGA)-R-(SN)-(LRKH)内，并指导了在简并位点进行丙氨酸取代。通过此分析，预测了三个11聚体共识肽能够捕获在先前描述的多重检测中观察到的针对MS特征表位的广泛体液免疫。所有三个BSA-共识肽与MS特征单克隆抗体的结合均显示与野生型BSA-BRRF2等效的亚纳摩尔级结合。
MS特征共识检测方法的开发与验证
评估了使用共识肽的Luminex检测的灵敏度、测定内和测定间精密度、从MS血清样本中回收低浓度单克隆抗体对照的能力、血清冻融后的信号回收以及特异性。该检测的低灵敏度和剂量依赖性动态范围确定为0.5-250纳克/毫升。在共识检测中，179份MS患者血清样本的子集显示阳性率为11%，而多重检测为8%。检测一致性良好。该检测在国防部血清库的纵向MS样本中，证明了其预测和持久特性，能够早在临床诊断前8年预测MS。
EBV介导的针对MS特征基序耐受打破的证据
比较了EPIC队列中179份MS患者样本与94份健康对照样本通过ELISA检测对GST-EBNA1或GST-BRRF2-C端的1/100血清阳性率。数据显示，BRRF2的免疫原性低于EBNA1，但对MS更具特异性。在MS特征阳性和阴性患者的血清和脑脊液中寻找了针对EBV EBNA1或BRRF2病毒抗原的IgG抗体。通过等电聚焦分离IgG，印迹到包被任一抗原的硝酸纤维素膜上，并用抗人IgG-HRP检测。仅在MS特征血清阳性患者的脑脊液中检测到针对BRRF2的IgG条带，并聚焦在与MS特征单克隆抗体相同的pI区域。针对EBNA1的IgG条带在MS特征阳性或阴性的MS患者中均有检测到，具有多种pI值，且抗体不仅限于脑脊液。
与MS特征存在交叉反应的中枢神经系统宿主抗原
利用MS特征单克隆抗体研究了含有该基序、可能促进MS疾病特异性和自身抗体持久性的中枢神经系统宿主抗原。对小鼠神经元细胞共培养物的体外免疫细胞化学显示，在星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞中存在显着的细胞内细胞骨架染色，与波形蛋白重叠。在星形胶质细胞中观察到波形蛋白、MS特征单克隆抗体和胶质纤维酸性蛋白的三重共定位。MS特征单克隆抗体也通过ELISA结合可溶性波形蛋白。尽管波形蛋白似乎是通过小鼠神经元细胞免疫细胞化学与MS特征单克隆抗体共染色的主要抗原，但也鉴定了其他含有该基序的中枢神经系统抗原。RIMS2是PhIP-Seq中的顶级肽段命中，是一种对突触膜胞吐作用和正常神经递质释放重要的突触前蛋白。ZNRF2和Reticulon RTN2B是使用MS特征单克隆抗体探测的蛋白质组芯片分析中的顶级命中。
讨论总结
本研究在807名UCSF EPIC队列的MS患者中确认了针对MS特征基序的血清自身抗体有约10%的流行率。这种疾病特异性和预测性标志物对MS早期阶段管理的潜在价值促使我们进一步优化和验证第二代血清学检测，以追求简单性、特异性和可靠性。一个重要的试剂是从一名MS患者的记忆B细胞中发现的针对MS特征的高亲和力、广泛交叉反应的人单克隆抗体。该单克隆抗体使我们能够评估检测的灵敏度和精密度，并为一致的血清阳性判定建立对照。针对MS特征P-(SA)-x-(SGA)-R-(SN)-(LRKH)基序的免疫集群在PhIP-Seq群体研究生成的热图中显示出对数百种人类和病原体蛋白共同的交叉反应。这些大型数据集用于精确定位一个短抗原列表，以便在多重微珠检测中进行进一步研究。然而，多克隆抗体血清对该基序序列背景的异质性和交叉反应性使得选择相关肽抗原的规则不明确。为了克服这种不确定性，我们分析了多种患者MS特征血清样本在一个包含短列表肽段的PhIP-Seq丙氨酸和终止扫描文库上的结果。这些结果使我们能够设计三个11聚体丙氨酸取代的共识肽，仅包含最少的必需独特残基，合并用于单个微珠分析物。我们的数据预测，共识肽将捕获在多重检测中观察到的针对MS特征表位的广泛体液免疫。在评估了使用MS特征单克隆抗体和共识肽的第二代检测的性能后，我们对179份MS样本进行了检测，确认了与早期多重检测结果的出色一致性和略高的血清阳性率。该检测还保持了在国防部血清库样本中最早在临床诊断前8年预测MS疾病的能力。共识检测中多出的8个阳性很可能可以通过不同微珠群上肽段之间缺乏竞争以及更准确地使用测定内临界点单克隆抗体对照来解释。在多重检测中阳性而在共识检测中阴性的3份MS血清样本可能是由于结合共识基序的更高严格性和特异性，以及使用了更准确的单克隆抗体测定内临界点对照。我们保留了目标血清稀释度1/500，以最小化健康对照血清样本在检测中的样本间变异性，这可能导致假阳性。如果可接受5%的假阳性阈值，这个稀释度很可能可以降低到1/100，这在结合其他标准来分配MS风险评分的环境中可能是可接受的。MS特征基序存在于数百种人类和病原体蛋白质中，健康的免疫系统应该是自身耐受的，不会产生针对它的IgG类别转换的记忆B细胞并分泌高亲和力的自身抗体。然而，我们的数据显示，在大约10%的MS病例中发生了对该基序的自身耐受打破。证实先前发表的工作，我们发现有若干证据表明EBV病毒被膜蛋白BRRF2是致病原因。BRRF2肽段在我们的检测和先前对MS患者血清样本的检测中都是Luminex多重检测的顶级命中，也是针对MS特征的单克隆抗体在VirScan中的顶级命中。针对BRRF2的寡克隆抗体在MS特征阳性患者的脑脊液IgG中富集，但血清中未富集，通过等电聚焦印迹检测。EBV gM也含有MS特征基序，是MS特征单克隆抗体在VirScan中的第二高命中，但在患者血清样本的Luminex检测中较少见。尽管不代表所有单克隆抗体，但广泛交叉反应的MS特征单克隆抗体分别以约1纳摩尔和6纳摩尔的亲和力结合EBV BRRF2和gM蛋白。MS特征基序在肽段和/或蛋白质序列中的背景呈现可能影响免疫识别和耐受。在具有该基序的顶级PhIP-seq肽段命中中，BRRF2肽段预测为完整的α螺旋，而在其他肽段中，该基序完全无序、在β链之间无序，或者在gM中，该表位预测既无序又呈螺旋状。EBV蛋白，特别是BRRF2和gM，可能是触发针对P-(SA)-x-(SGA)-R-(SN)-(LRKH)基序的耐受打破自身抗体的早期诱因。我们测量到的BRRF2相对于EBNA1相对较低的免疫原性可以解释大约10%的MS特征流行率，这也只在与耐受打破同时发生时出现，但仍需用对MS疾病的特异性来解释。我们在混合神经元细胞培养物中鉴定的MS特征单克隆抗体的主要宿主抗原靶标是波形蛋白。先前有报道称，77%的传染性单核细胞增多症患者，但很少对照参与者，会产生针对波形蛋白的血清IgM抗体。这种自身免疫发生在总IgM升高的同时，并在EBV感染后6个月消退。传染性单核细胞增多症病史与晚年发生MS的风险增加两倍相关。波形蛋白在EBV中的作用尚未明确，但耐受打破可能通过中枢神经系统中功能失调的EBV B细胞伴随炎症而发生并持续。在MS特征阳性患者的脑脊液寡克隆区带中，针对BRRF2的抗体可能由来自EBV感染记忆B细胞或共享该基序的人类中枢神经系统抗原的抗原所维持。在这方面，星形胶质细胞积极参与炎症性MS病变的发展和进展，在胶质增生期间与GFAP共表达波形蛋白，并释放细胞外波形蛋白。尽管波形蛋白自身抗体并非MS特有，但我们的数据支持那些针对特定交叉反应MS特征表位的抗体是独特的。就MS特征而言，其他含有该基序的中枢神经系统蛋白质的贡献，例如RIMS2或ZNRF2，可能增加MS的异质性。此外，基序内或周围的翻译后修饰，或表位扩展至包含不连续或构象依赖性区域，可能改变免疫原性，并促进自身免疫特异性和流行率。了解MS特征自身抗体的起源和驱动因素可能拓宽MS生物标志物的发现，指出触发MS疾病的机制，并改善预防和管理。本文描述的血清学检测为未来在大型前瞻性临床队列中与其他已建立和新兴的生物标志物一起进行联合MS风险评分交叉验证研究提供了原理验证。
