《Plant Biotechnology Journal》：FvMAPK6-Mediated FvMYB44s/FvSWEET1 Dual-Layer Regulation Modulates Sugar Accumulation in Strawberry Fruit, With FvSPS3 Enabling Quality–Yield Balance
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本研究首次在草莓中揭示了MAPK6（FvMAPK6）通过磷酸化级联FvMKK4，直接磷酸化转录因子FvMYB44.1/44.2和己糖转运蛋白FvSWEET1，形成“双层面调控”机制，协同促进果实糖分与花青素积累。研究进一步发现，该通路可被蔗糖信号激活，构成正反馈环，而直接调控其下游靶点FvSPS3可突破传统糖分积累与产量的负相关限制，为作物品质育种提供了全新策略。
引言：果实糖分积累的调控与挑战
糖分是决定果实品质的关键，它不仅作为代谢物影响风味，还充当调控花青素积累等成熟过程的信号分子。然而，关于非呼吸跃变型果实（如草莓）中糖分积累及其信号传导的分子网络仍不完全清晰。在作物改良中，糖分含量高与产量高之间的负相关是一个主要挑战，因此，解析调控糖分积累的分子机制，对协同提升果实品质与农业生产率至关重要。林地草莓（Fragaria vesca）为此提供了一个优秀的模型系统。果实糖分含量由代谢酶（如蔗糖磷酸合成酶FvSPS3、蔗糖合酶FvSUS1/2等）和转运蛋白（如糖最终会被输出转运蛋白FvSWEET1）的相互作用决定。在转录水平，MYB转录因子是糖代谢和花青素生物合成的重要调节因子，其中FaMYB44.2已被证明可抑制草莓糖分积累。然而，调控MYB44活性的上游因子，特别是如何响应糖信号，尚不清楚。翻译后修饰，特别是磷酸化，是调控糖代谢的关键层面。本研究旨在填补这些知识空白，探索MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）通路在协调草莓果实糖分与花青素积累中的潜在作用。
结果
FvMAPK6调控草莓果实中糖分与花青素的协同积累
为鉴定与FvMYB44.2相互作用并可能参与糖分积累的蛋白质，研究者进行了质谱分析，结果鉴定出FvMAPK6。通过构建稳定过表达和CRISPR/Cas9编辑的突变体植株，研究发现FvMAPK6过表达果实的糖分（葡萄糖、果糖、蔗糖）和花青素积累加速，而突变体果实则表现出延迟积累。转录组分析显示，FvMAPK6调控了与花青素合成（如FvCHI）和糖代谢/转运（如FvSPS3、FvSWEET1）相关的关键结构基因，其中糖相关基因的变化更为显著。此外，FvMAPK6还调控了多个与果实成熟相关的转录因子基因（如FvMYB10、FvMYB44.2、FvWRKY50等）的表达，暗示其可能在翻译后水平调控这些因子的活性。
FvMAPK6通过磷酸化FvMYB44.1和FvMYB44.2调控其降解与转录活性
FvMAPK6与FvMYB44.1/44.2之间的直接相互作用通过pull-down、双分子荧光互补和荧光素酶互补成像实验得到证实。研究者通过酵母双杂交和免疫沉淀-质谱分析，确定FvMAPKK4是FvMAPK6的上游激酶。体外激酶实验表明，被FvMAPKK4激活的FvMAPK6能够磷酸化FvMYB44.1的Ser-62位点和FvMYB44.2的Ser-226位点。与FvMYB44.2主要调控蔗糖积累不同，瞬时实验显示FvMYB44.1通过直接结合下游基因（如FvCHI、FvSPS3、FvSUS2、FvSWEET1）的启动子，负向调控花青素、蔗糖、果糖和葡萄糖的积累。
细胞游离降解实验和免疫印迹分析表明，FvMAPK6通过26S蛋白酶体途径促进了FvMYB44.1/44.2的降解，其在果实成熟期间的蛋白质丰度下降。在草莓果实中进行的转录报告实验进一步证实，FvMAPK6介导的磷酸化削弱了FvMYB44.1/44.2对下游基因（FvCHI、FvSPS3、FvSWEET1）的转录抑制作用。这些结果证明，FvMKK4-FvMAPK6级联通过磷酸化负向调控FvMYB44.1/44.2的稳定性和转录活性。
FvMAPK6磷酸化己糖转运蛋白FvSWEET1以调控其功能
除了通过磷酸化转录因子调控基因表达，蛋白激酶还能直接磷酸化功能蛋白。基于FvMAPK6转基因果实的磷酸化蛋白质组学分析发现，糖转运蛋白FvSWEET1的磷酸化水平显著改变，其蛋白质丰度在FvMAPK6过表达果实中更高。
系统进化树分析表明FvSWEET1属于SWEET亚家族I，酵母生长互补实验证实其功能为转运葡萄糖和果糖的己糖转运蛋白，且定位于质膜。FvMAPK6与FvSWEET1存在相互作用。Phos-tag分析表明FvSWEET1的磷酸化水平受FvMAPK6调控。磷酸化蛋白质组学在FvSWEET1的C端第223位丝氨酸位点检测到磷酸化。将该位点突变为天冬氨酸的磷酸模拟突变体FvSWEET1D表现出增强的葡萄糖转运活性，而突变为丙氨酸的磷酸化缺陷突变体FvSWEET1A则活性降低，证明FvMAPK6介导的磷酸化对维持其转运活性至关重要。
蔗糖信号激活FvMAPK6–FvMYB44s/FvSWEET1双调控模块以调控草莓果实糖分积累
已知50 mM蔗糖处理可模拟蔗糖信号，促进草莓果实成熟。研究发现，蔗糖处理能显著激活野生型和FvMAPK6过表达果实中的FvMAPK6，但对Fvmapk6突变体果实的激活作用大幅减弱，表明FvMAPK6是草莓果实细胞中蔗糖信号通路的关键组分。与野生型相比，蔗糖处理能更大程度地增强FvMAPK6过表达果实中的花青素和糖分积累，而在突变体中这种增强被延迟。蔗糖处理还以FvMAPK6依赖的方式显著改变了其下游磷酸化靶标FvMYB44.1和FvSWEET1的蛋白质水平。
转录报告实验表明，FvMAPK6通过磷酸化FvMYB44s来微调蔗糖响应，进而调控FvCHI和FvSPS3等基因的表达。同时，研究发现蔗糖处理能进一步增强野生型FvSWEET1过表达果实的糖分积累，但对磷酸模拟突变体FvSWEET1D的果实无叠加效应。这提供了关键证据，表明蔗糖主要作为信号分子来增强FvSWEET1介导的己糖转运，而非仅仅作为代谢前体。综上，FvMAPK6作为蔗糖信号的中心枢纽，通过磷酸化不同的下游靶标（转录调节因子FvMYB44s和转运蛋白FvSWEET1）来协同调控草莓果实的糖分和花青素积累。
FvSPS3在不影响生长和产量的前提下提高草莓果实糖含量
虽然过表达FvMAPK6能显著提高果实糖分，但会导致植株矮化和产量降低，而Fvmapk6突变体植株则表现出增强的生长和产量，凸显了FvMAPK6在介导生长/产量与果实品质权衡中的多效性。为克服此权衡，研究者筛选了FvMAPK6调控网络中功能更特异地指向果实成熟的下游组分，并聚焦于蔗糖生物合成途径中的关键酶FvSPS3。
构建的FvSPS3过表达植株表现出正常的形态和结实特性，未出现FvMAPK6过表达带来的生长缺陷。FvSPS3过表达果实的花青素和糖分积累加速。在达到商业成熟度时，FvSPS3过表达果实积累了显著高于野生型的糖分。这些发现将FvSPS3定位为改善草莓果实品质的一个极具前景的特异性育种靶点。
讨论
本研究首次提供了FvMAPK6直接调控果实内源糖分积累的遗传证据，并揭示了其在草莓中协调品质与产量权衡的关键作用。FvMAPK6作为蔗糖响应的激酶，通过“双重机制”协调糖分和花青素积累：其一是通过直接磷酸化转录抑制因子FvMYB44.1/44.2介导的转录途径；其二是通过磷酸化己糖转运蛋白FvSWEET1介导的翻译后途径。蔗糖处理可激活并放大这一调控，形成一个正反馈环。
虽然直接调控上游激酶FvMAPK6会导致产量损失，但通过精准靶向其下游效应子FvSPS3，可以成功实现果实品质提升而不损害产量，为作物育种提供了可行的策略。该研究不仅揭示了草莓糖分积累的新调控途径，也为理解MAPK信号、MYB转录因子和SWEET转运蛋白在植物碳水化合物分配中的复杂网络提供了新见解，其机制可能在不同作物中具有保守性，为更广泛的作物品质改良开辟了前景。
实验流程与方法概要
研究使用二倍体草莓‘Ruegen’和八倍体栽培草莓‘红颜’等材料。通过Gateway克隆、CRISPR/Cas9基因组编辑、农杆菌介导的稳定和瞬时转化进行功能验证。采用酵母双杂交、双分子荧光互补、荧光素酶互补成像、pull-down、免疫共沉淀-质谱等技术分析蛋白相互作用。通过体外激酶实验、Phos-tag分析、4D-快速数据非依赖性采集定量磷酸化蛋白质组学等方法检测蛋白磷酸化。利用酵母生长互补实验测定FvSWEET1的转运特性。通过高效液相色谱和植物花青素含量试剂盒测定糖分和花青素含量。通过实时荧光定量PCR、转录组测序、电泳迁移率变动分析、GUS报告基因活性测定等进行基因表达和转录调控分析。蛋白质提取和免疫印迹使用特异性抗体（如抗磷酸化p44/42 MAPK、抗FvMYB44.1、抗FvSWEET1等）。数据统计分析采用GraphPad Prism和SPSS软件。
