《Journal of Advanced Research》：Systematic profiling of human gut bacteria with cyclic di-AMP secretion to enhance anti-tumor immunity
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本研究为解决c-di-AMP（一种可激活STING通路的细菌信号分子）在人肠道共生菌中的产生与功能认知有限的问题，系统表征了51种代表性肠道菌c-di-AMP的代谢谱与相关基因型，并验证了高产c-di-AMP的益生菌（如Limosilactobacillus fermentum DA785）在NSCLC模型中通过激活肿瘤微环境中T细胞介导的免疫反应来抑制肿瘤生长，为开发基于微生物组的癌症治疗新策略提供了依据。
在人体这个复杂的生态系统中，居住着数万亿的肠道微生物，它们不仅是消化食物的帮手，近年来更被科学家发现是调节人体免疫系统、影响疾病（包括癌症）进展的关键“盟友”。肠道菌群能产生多种化学分子，其中，环二腺苷酸（cyclic di-adenosine monophosphate, 简称c-di-AMP）作为一种细菌信使分子，备受关注。它被发现是宿主免疫应答中一个名为“STING”通路的关键激活剂。激活STING通路，如同按下了免疫系统的“警报按钮”，能引发一系列连锁反应，最终召唤出强大的免疫细胞（如细胞毒性T细胞）来攻击肿瘤。因此，利用c-di-AMP来增强抗肿瘤免疫，成为一种充满希望的癌症治疗新思路。
然而，理想很丰满，现实却很骨感。直接使用c-di-AMP或其类似物进行治疗，面临着“体内半衰期短、易降解、全身毒性大”等诸多挑战。与此同时，大自然似乎提供了更优解：我们肠道内的共生菌本身可能就是源源不断的c-di-AMP“微型生产工厂”。如果能够筛选出那些高产且能有效分泌c-di-AMP的“好细菌”，并加以利用，或许就能实现更持久、更安全、靶向性更强的免疫激活。可是，科学界对肠道细菌产生c-di-AMP的能力和机制知之甚少。哪些肠道细菌是c-di-AMP的“高产大户”？它们携带哪些相关的“生产”（合成）、“销毁”（降解）和“运输”（分泌）基因？这些细菌产生的c-di-AMP能否有效激活免疫、对抗肿瘤？这些问题都悬而未决，严重阻碍了我们将肠道菌群理性应用于癌症治疗的步伐。
为了填补这一知识空白，由澳门科技大学中华医药研究院的Zheng Linggang、Huang Jumin等人领导的研究团队，在《Journal of Advanced Research》上发表了一项开创性研究。他们决心对人类的肠道细菌进行一次系统的“能力普查”和“深度面试”，目标是找到那些具有强大c-di-AMP生产与分泌能力的“明星益生菌”，并验证它们激活免疫、抗击肿瘤的“真才实学”。
研究者们首先从119名健康志愿者的粪便样本中，分离培养了442株肠道细菌，并对其中的51种代表性菌种进行了深入研究。他们采用了多组学联用的策略：一方面，通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术精准定量细菌细胞内和分泌到培养上清中的c-di-AMP水平，从“代谢表型”上筛选高产菌株。另一方面，通过对超过400个肠道细菌基因组进行生物信息学分析，预测并注释了与c-di-AMP合成、降解和分泌相关的基因（如DACs, PDEs, 转运蛋白），从“基因型”上探究其分子基础。在细胞水平，他们用筛选出的高产菌株培养上清与THP-1细胞共培养，评估其激活STING通路和诱导干扰素-β（IFN-β）产生的能力。在动物水平，他们构建了非小细胞肺癌（NSCLC）小鼠模型，通过口服给予活菌，在体评估其抑制肿瘤生长、调节肿瘤微环境免疫应答的效果。
研究一开场，研究人员就确认了“主角”c-di-AMP的实力。 在非小细胞肺癌小鼠模型中，直接腹腔注射c-di-AMP能显著抑制肿瘤生长，并且这种效果与肿瘤微环境中细胞毒性CD8+T细胞分泌的干扰素-γ（IFN-γ）和颗粒酶B（GZMB）水平升高有关，而在脾脏和外周血中则没有观察到系统性免疫激活，提示了其作用的局部特异性。
随后，研究进入核心环节：对肠道细菌c-di-AMP生产能力的大规模“筛查”。 通过对51种肠道细菌的代谢分析，研究人员发现有24种是c-di-AMP的“高产菌”，其中18种还表现出强大的分泌能力。有趣的是，基因预测与实验结果并非完全吻合。例如，大多数拟杆菌门（Bacteroidota）细菌虽然预测含有合成酶基因，但实际产量却很低；而一些双歧杆菌（Bifidobacterium）虽未检测到典型的合成酶基因，却能产生c-di-AMP。这提示，仅凭基因序列预测代谢功能存在不确定性，可能存在未知的合成机制或严格的调控机制。系统发育树分析显示，高产c-di-AMP的菌株主要集中在厚壁菌门（Firmicutes）和放线菌门（Actinobacteriota）。
接下来，研究聚焦于“分泌”能力，因为只有被细菌分泌出来的c-di-AMP才能与宿主免疫细胞相互作用。 代谢组学数据揭示，c-di-AMP的分泌能力在不同菌株间差异巨大。通过比较细胞内和细胞外c-di-AMP水平，研究锁定了18株“能产又能分泌”的优秀菌株。生物信息学分析试图寻找已知的c-di-AMP转运蛋白基因，但发现许多能分泌c-di-AMP的菌株并不携带这些预测的转运基因，表明可能存在全新的、未知的分泌机制。在筛选中，两株食品级益生菌脱颖而出：发酵粘液乳杆菌（Limosilactobacillus fermentum）DA785和鼠李糖乳杆菌（Lacticaseibacillus rhamnosus）R7970，它们展现了卓越的c-di-AMP分泌能力。
那么，这些“明星益生菌”产生的c-di-AMP是否真的能“干活”——激活免疫呢？ 细胞实验给出了肯定的答案。用L. fermentum DA785和L. rhamnosus R7970的培养上清处理人单核细胞（THP-1），能显著上调STING通路关键因子IRF3的表达，并促进下游细胞因子IFN-β的分泌，效果与直接添加c-di-AMP或已知的产c-di-AMP菌阿克曼菌（Akkermansia muciniphila）相当，而不产c-di-AMP的细菌则无此效果。
最激动人心的证据来自活体动物实验。 在非小细胞肺癌小鼠模型中，通过口服灌胃给予活的L. fermentum DA785或L. rhamnosus R7970，能够显著抑制肿瘤生长，其效果与直接注射c-di-AMP类似。机制探究发现，这种抗肿瘤效应依赖于它们激活了肿瘤微环境中的免疫应答：口服益生菌处理组的小鼠，其肿瘤组织内CD8+T细胞的活化和杀伤功能（表现为IFN-γ和GZMB表达升高）显著增强。同样，这种免疫激活具有器官特异性，主要局限于肿瘤微环境，而未引起脾脏和外周血的系统性免疫变化，这暗示了潜在的安全性优势。关键的机制验证实验表明，在STING基因敲除（STING-/-）的小鼠中，L. fermentum DA785的抗肿瘤效果完全消失，这直接证明了其作用依赖于宿主STING通路。
综上所述，本研究首次对源自健康人肠道的细菌进行c-di-AMP代谢能力的系统性剖析，绘制了其代谢表型与基因型图谱。研究成功筛选出包括L. fermentum DA785和L. rhamnosus R7970在内的多株高产c-di-AMP的食品级益生菌。这些益生菌能有效激活STING通路，并在非小细胞肺癌模型中，通过特异性增强肿瘤微环境中细胞毒性T细胞的免疫应答，实现显著的肿瘤抑制效果，且该效果依赖于完整的STING信号。
这项研究的意义重大。首先，它极大地拓展了我们对肠道菌群“免疫药箱”的认识，将c-di-AMP的生产能力从个别已知菌（如阿克曼菌）扩展到一个更广泛的细菌类群。其次，研究提出了“利用高产c-di-AMP的益生菌作为活体递送系统”的全新策略。相比于化学合成、半衰期短的c-di-AMP药物，这些益生菌可以在肠道内持续、局部地生产和递送c-di-AMP，可能实现更持久、更安全的免疫调节，为解决c-di-AMP临床应用瓶颈提供了创新思路。最后，研究鉴定的具体菌株（如L. fermentum DA785）为开发下一代微生物组辅助疗法或基于益生菌的肿瘤免疫治疗产品奠定了坚实的候选基础，标志着我们从“认识菌群”向“精准利用菌群”迈出了关键一步。当然，研究也存在局限，例如未能通过基因敲除在益生菌中直接验证特定基因的功能，以及尚未完全排除其他细菌代谢物贡献的可能性，这为未来更深入的功能机制研究指明了方向。
