《Smart Molecules》：Photo-induced proton release of spiropyran-derived nanomaterials for mRNA delivery in hard-to-transfect cells
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本研究报道了一种新型螺吡喃衍生类脂质材料（SPALs），其可通过460 nm光照射引发螺吡喃结构的关环异构化并原位释放质子，这些质子促使类脂质尾部三级胺质子化，从而破坏纳米颗粒（NPs）的结构稳定性并增强其内体逃逸能力，最终显著提升了在难转染的RAW 264.7巨噬细胞中的mRNA（EGFP mRNA）转染效率（例如SPAL1使EGFP阳性率从59%提升至72%），为基于mRNA的疗法提供了一种光控增强递送的新策略。
1 引言
信使RNA（mRNA）疗法通过直接调控蛋白质表达，已成为治疗多种疾病的一种前景广阔且具有变革性的方法。然而，mRNA由于其固有的不稳定性（易被核糖核酸酶降解）和强聚阴离子特性，难以被活细胞直接摄取和利用。因此，开发有效的mRNA递送系统对于保护mRNA免于降解并增强其细胞摄取至关重要。在已报道的平台中，类脂质材料（Lipid-like materials）已成为一类重要的mRNA递送载体，其核心结构包含多个三级胺和疏水性长链烷基侧基，能够通过静电和疏水相互作用有效包裹mRNA，形成亲脂性纳米颗粒（NPs），从而促进mRNA进入活细胞。然而，与大多数已报道的mRNA递送平台类似，类脂质纳米颗粒（LLNs）在不同细胞系中表现出不同的mRNA表达效率，尤其是在固有转染或表达效率低的细胞系中，增强递送效率仍是一个重大挑战。根据文献，内体逃逸是高效mRNA表达的关键前提。为了克服内体逃逸障碍，人们探索了多种策略。本研究旨在通过聚焦类脂质材料的结构特性来增强mRNA递送效率。其核心三级胺是可离子化的，为结合mRNA提供了主要的静电作用力。我们提出，将螺吡喃（Spiropyran, SP）部分引入类脂质分子中，使其能够在光诱导下产酸，从而通过原位质子化促进内体逃逸。
2 结果与讨论
2.1 SPALs的设计与合成
我们首先通过酯键连接螺吡喃支架和类脂质尾部，设计并合成了一个小型化合物库SPAL1-6。螺吡喃可作为光产酸剂，在光照下发生可逆的结构异构化。具体而言，螺吡喃衍生物在460 nm光照射下，可从开环形式转变为闭环形式，同时释放一个质子。我们修饰了螺吡喃上两个位置（R1和R2）的取代基，以评估它们对质子解离行为的影响。通过改变R1取代基，可以调节螺吡喃的响应范围；改变R2取代基可以调节螺吡喃部分的整体电子性质，从而调节纳米颗粒的细胞摄取和转染效率。该系列分子通过模块化方法以高产率合成，所有化合物均得到充分表征。
2.2 螺吡喃核心的光诱导异构化与质子生成
我们首先研究了这些螺吡喃的pH响应及其光诱导异构化和产质子效应，以证明它们质子化类脂质尾部三级胺的潜力。螺吡喃的光诱导异构化发生在开环和闭环状态之间，这两种状态具有不同的π共轭体系，对应于不同的吸收光谱特征。我们对这些螺吡喃在乙醇/水混合物中进行pH滴定，并记录相应的紫外-可见吸收光谱以确定其工作pH范围。随着pH降低，425 nm附近的吸收峰显著增加，而280 nm附近的吸收峰降低。根据滴定曲线，我们计算了光诱导关环过程的pKa值。我们观察到芳香环上的R1取代基显著影响pKa。例如，在R1位置引入给电子的甲氧基导致SP1的pKa值低于SP2。从pKa的角度看，SP1和SP5具有~6.0的理想pKa值，这使得它们能够在接近内体pH值下应用。接着，我们研究了这些螺吡喃核心的光诱导异构化和产质子效应。我们用460 nm光照射乙醇/水混合物中的螺吡喃支架，并随时间记录其紫外-可见吸收光谱。在光照射下，460 nm附近的吸收峰在平均5-10秒内消失，表明光诱导的关环转化高效且快速。照射后，溶液明显褪色，从黄色变为近乎透明。其快速响应能够实现质子的快速释放，从而改变内体微环境的酸度，促进内体破坏和后续核酸的释放。此外，我们测量了照射前后螺吡喃溶液的pH值，观察到下降了0.18-0.52个单位，表明照射后产生了质子。其中，SPAL1显示出最显著的pH下降，达0.52个单位。这些特性符合我们利用光诱导质子调节LLN结构的预期。同时，460 nm附近的吸收峰在黑暗中20分钟内逐渐恢复到原始水平，表明闭环螺吡喃可以自发恢复为开环形式。
2.3 光照前后SPAL LLNs的特性表征
然后，我们研究了光照前后SPAL LLNs的特性变化，包括粒径、多分散指数（PDI）和Zeta电位。我们根据先前报道的方法将SPALs配制成SPAL LLN制剂。制剂组分包括SPALs、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DOPE）、胆固醇、1,2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000（DMG-PEG2000）和增强绿色荧光蛋白（eGFP）mRNA。SPAL LLN制剂中各组分的摩尔比为20/30/40/0.75（SPALs/DOPE/胆固醇/DMG-PEG2000）。光照前，SPAL1-6 LLNs的尺寸测量为200-300 nm，PDI低于0.4。Zeta电位范围为-20至-5 mV。暴露于光（460 nm，300秒）后，SPAL1-6 LLNs的尺寸略有增加，同时Zeta电位发生明显变化。纳米颗粒尺寸的增加伴随着表面电位的变化，表明内部类脂质材料与包裹的mRNA之间的相互作用可能发生了改变，意味着结构完整性部分丧失和颗粒稳定性降低。PDI的增加进一步支持了纳米颗粒群从相对均质状态向更异质状态的转变。我们提出，光照产生的质子降低了纳米颗粒内部局部微环境的pH，导致颗粒组装体的结构扰动。在纳米颗粒水平观察到的pH诱导不稳定性，可能反映了伴随增强的内体破坏和逃逸的部分纳米颗粒解组装，最终有助于提高转染效率。
2.4 光照条件下SPALs用于mRNA递送的筛选
接着，我们在RAW 264.7细胞中评估了包裹eGFP mRNA的SPAL LLNs的mRNA递送能力。该细胞系是小鼠单核巨噬细胞白血病细胞，其高度活跃的吞噬特性导致细胞不断内化并降解胞外物质，因此外源性脂质体很难在这些细胞中实现成功的内体逃逸。这一固有特性导致即使使用商业mRNA递送试剂如lipo3000，其转染率也较低（<30%）。在此实验中，我们在96孔板中以每孔125 ng的剂量用新鲜制备的LLNs处理细胞9小时。对于照射组，在转染的第3小时用460 nm LED光照射细胞5分钟。通过共聚焦显微镜成像比较基于eGFP绿色荧光的转染效率。我们观察到，在SPAL1 LLN和SPAL2 LLN组中，无论是否照射，都观察到了强烈的绿色荧光。我们发现，在光照射下，SPAL1和SPAL2 LLNs组的GFP荧光明显增加，这表明螺吡喃的光诱导关环异构化增加了蛋白质表达。我们进一步提出，光激活产生的质子可能与磺酸盐基团结合形成磺酸，其更强的酸性可能促进更高效的内体逃逸。从溶液中的pH变化（约0.3-0.5个单位）也支持酸性增加有助于逃逸的观点。通过MTT实验证明，光照不会引起显著的细胞毒性差异。随后，我们进行了流式细胞术定量评估mRNA递送能力。在48孔板中以每孔375 ng的剂量用新鲜制备的LLNs处理细胞9小时。对于照射组，在转染的第3小时用460 nm LED光照射细胞5分钟。收集细胞并用流式细胞仪分析。结果显示，SPAL1和SPAL2 LLNs的eGFP阳性率最高，分别为59%和44%。在光照射组中，SPAL1和SPAL2 LLNs的eGFP阳性率分别提高到72%和61%。这表明SPAL1和SPAL2 LLNs在光照射后eGFP阳性率分别提高了22%和39%。在相同RNA浓度下使用商业转染试剂Lipo3000进行流式细胞术分析，其eGFP阳性率为34%。SPAL1和SPAL2的eGFP阳性率显著高于Lipo3000。我们还检测了转染阳性细胞的平均荧光强度。与未照射组相比，光照射组eGFP的平均荧光强度略有下降。为了评估光诱导的生物学或物理化学效应，我们对使用商业试剂Lipo3000转染的细胞在光照前后进行了流式细胞术分析。结果显示，光照前后转染率无显著差异。这些结果表明，光诱导的质子释放促进了颗粒和内体的破坏，从而提高了mRNA转染率。鉴于上述结果，我们试图直接在活细胞中证明光照射产生的质子。我们通过添加4%（重量百分比，相对于SPAL1）的pH敏感类脂质材料RPHL来配制SPAL1 LLNs。RPHL是一种与类脂质尾部连接的比率型pH探针，在中性和碱性pH下主要显示来自BODIPY的绿色荧光，而在酸性pH下主要观察到红色发射。红色荧光（Ired）与绿色荧光（Igreen）的比率可用于半定量指示pH。我们在96孔板中用新鲜制备的LLNs处理细胞3小时。光照射后立即用共聚焦显微镜对细胞成像。对细胞内荧光的定量分析显示，光照射后内体中平均荧光比率（Ired/Igreen）从1.30增加到1.70。该比率的增加表明内体pH降低，暗示光照射诱导的螺吡喃关环异构化产生了质子，从而降低了内体pH。同时，我们发现照射后内体荧光从清晰的点状逐渐变为边缘模糊，表明颗粒结构发生变化并加速了内体逃逸。
3 结论
总之，我们合成并筛选了一系列螺吡喃衍生的类脂质纳米材料。我们证明了它们的光诱导异构化、质子生成和递送效率，并与lipo3000进行了比较。我们发现SPAL1-6在460 nm光照射下发生关环反应，产生质子并降低局部微环境pH。这一过程有助于增强内体逃逸。我们通过递送材料与编码GFP的mRNA自组装构建了纳米颗粒，并将其转染到巨噬细胞中。我们观察到，光照射使SPAL1 LLNs的转染效率从59%提高到72%。这个数字显著高于同一细胞系中的lipo3000（34%）。这些结果表明，螺吡喃的光诱导质子释放能够破坏纳米颗粒和内体膜的稳定性，从而促进内体逃逸并最终增强转染性能。因此，我们设计的新型类脂质纳米材料进一步提高了在RAW 264.7细胞中的递送效率。总体而言，先导化合物SAPL1 LLNs值得进一步研究和应用。
4 实验部分/方法
所有化学品均购自商业供应商，未经进一步纯化即使用。熔点使用未校正熔点仪测定。核磁共振氢谱和碳谱在氘代氯仿中以四甲基硅烷为内标测定。柱色谱使用硅胶（200-300目）进行。所有溶剂混合物均以体积/体积比给出。荧光量子产率使用荧光素作为参照物测定。
RAW 264.7（巨噬细胞）在补充了10%胎牛血清的DMEM培养基中，在5% CO2和95%空气、37°C的条件下培养。对于mRNA转染研究，将处于指数生长期的巨噬细胞接种到35毫米十字形分隔共聚焦皿中，每室500 μL DMEM。在37°C、5% CO2下孵育24小时后移除培养基。然后将新鲜制备的纳米颗粒储备液加入DMEM培养基中。孵育3.5小时后，细胞暴露于460 nm LED光下5分钟，随后继续孵育6小时。然后使用共聚焦激光扫描显微镜进行共聚焦成像。
在细胞培养程序方面，流式细胞术的实验步骤与共聚焦显微镜基本相同。用500 mL磷酸盐缓冲液洗涤后移除培养基，将细胞重悬于离心管的300 μL培养基中。在FACScan流式细胞仪上，用488 nm蓝宝石激光照射样品。每组样品在1分钟内检测10,000个细胞。使用FlowJo软件分析流式细胞术数据。
