《Advanced Science》：Microglia Mitochondria Support Neuronal Maturation via Metabolic and Transcriptional Reprogramming in Human 3D In Vitro Brain Model
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本研究利用三维人源体外脑模型，首次揭示了小胶质细胞来源的线粒体可通过直接转移，作为可传递的信号分子促进神经元的代谢、线粒体动力学及转录重编程，从而加速其成熟进程。该研究不仅证实了小胶质细胞线粒体转移是神经发育的重要调节因子，其诱导的转录组变化与自闭症谱系障碍（ASD）相关生物学存在部分重合与分离，为理解ASD等神经发育疾病的细胞机制提供了新视角。
摘要
自闭症谱系障碍是一种神经发育疾病，其特征之一是神经元环路成熟的紊乱。小胶质细胞功能与线粒体调节被认为是ASD相关生物学的重要参与者，然而这些过程与神经元发育之间的关联机制尚不明确。神经元成熟需要代谢与转录重塑的紧密协调，其中线粒体在调节发育节律和代谢特征中扮演核心角色，而小胶质细胞则调节神经元突触网络的成熟。本研究利用三维人源体外脑模型，首次证明小胶质细胞线粒体可作为可传递的调节信号，促进神经元成熟的代谢、线粒体动力学和转录层面。接受小胶质细胞线粒体处理的神经元，其氧化代谢增强、线粒体动力学改善，并激活了与神经系统发育和神经发生相关的基因程序。这些效应伴随着树突成熟标志物表达的增加，支持了转移的线粒体可参与调节神经元状态的观点。然而，神经元完全的结构和突触成熟，需要小胶质细胞来源的线粒体与其分泌的信号因子共同作用。综上，本研究确立了小胶质细胞线粒体转移是神经元成熟的重要贡献者，这对于理解在ASD中被扰乱的发育轨迹具有潜在意义。
1 引言
神经元的发育与成熟是一个编排精妙、高度动态的过程，引导功能性神经环路的形成。该过程从早期神经发生一直延伸到青春期和成年期。神经元成熟由内在的遗传程序与外在的环境信号复杂交互所调控，这包括神经元-胶质细胞互作、突触活动、分泌分子、代谢状态和线粒体功能。这些发育程序的任何扰乱都可能导致神经元结构与功能的广泛改变，表现为异常的突触形成、轴突/树突生长延迟、GABA能信号受损、氧化应激增加和神经炎症。
自闭症谱系障碍是一种日益被认为与神经元成熟受阻相关的神经发育疾病。在美国，约每36名儿童中就有1人受到影响。ASD以社交互动与沟通缺陷以及限制性和重复性行为为特征。虽然遗传学在ASD发展中作用重大，但环境与免疫因素也扮演着关键角色。现有的疗法主要针对症状，而非疾病的根本原因，这凸显了理解ASD生物学的迫切需求。
神经发育模型日益将受损的神经元成熟和异常的突触修剪视为ASD病因的促成因素。在出生后早期发育阶段，大脑会生成大量的突触连接，随后通过活动依赖的修剪来优化，以建立高效、适应性强的神经环路。小胶质细胞作为大脑的常驻免疫细胞，是此过程的核心。它们调节多余突触的消除、调控树突重塑，并有助于平衡中枢神经系统内的兴奋性与抑制性信号。小胶质细胞活动的失调，包括突触吞噬受损和神经元-小胶质细胞信号传导（例如，通过CX3CL1–CX3CR1轴）紊乱，已在多个ASD模型中被揭示，并与该疾病的特征行为表型相关。这些发现强调了在早期大脑发育中小胶质细胞-神经元通讯的至关重要性。
在分子水平上，神经元成熟标志物的表达紊乱，以及以TMEM119和TGFβ1表达改变为标志的异常小胶质细胞表型，已在神经发育障碍患者组织和动物模型中被观察到。这些数据共同指向了神经-胶质交互的广泛失败，这导致了在ASD患者中观察到的发育偏差。
与有缺陷的修剪相平行，线粒体功能障碍已成为ASD发病机制的关键因素。除了在细胞能量生产中的作用外，线粒体现被认为是神经元增殖、分化和突触形成的核心调节者。发育中的大脑有很高的代谢需求，需要高效的线粒体氧化磷酸化。然而，ASD个体常表现出线粒体功能受损，证据包括ATP水平降低、电子传递链活性失调、氧化应激升高以及异常的代谢物谱。此外，线粒体动力学的紊乱导致线粒体碎片化、活性氧积累和神经元功能障碍，这些标志在ASD患者的死后脑组织中也存在。
小胶质细胞-神经元代谢交互最近已成为涉及神经发育疾病的新机制轴。小胶质细胞能够将功能性线粒体转移给受压的神经元，调节代谢谱，并增强线粒体可塑性。这些发现表明，小胶质细胞不仅通过突触重塑促进神经元发育，还能直接影响神经元的生物能量能力。然而，这种支持的确切机制，无论是通过物理接触、分泌囊泡还是代谢中间产物，仍然知之甚少，特别是在神经发育的背景下。
尽管机制性认识在增长，但小胶质细胞与神经元之间的物理细胞-细胞接触是否是产生这些有益效果所必需的，或者小胶质细胞来源的线粒体和代谢物是否能独立地影响神经元成熟，仍然不清楚。为填补这一知识空白，本研究利用人类三维体外脑模型，探究了小胶质细胞线粒体支持在神经元发育中的作用。结果发现，小胶质细胞线粒体部分促进了神经元成熟，并在处理后48小时就诱导了转录改变。然而，完全的发育支持需要额外的小胶质细胞衍生信号和直接的神经元-小胶质细胞相互作用。这些发现为小胶质细胞如何促进神经元成熟提供了机制性见解，并指出线粒体转移是理解ASD细胞基础的潜在途径。
2 结果
2.1 小胶质细胞在三维人源体外模型中促进神经元成熟与网络发育
为探索小胶质细胞在促进神经元成熟方面的益处，研究使用了三维人源体外组织模型。该模型由诱导性神经元干细胞和带有荧光标记线粒体（分别为dsRED2和EBFP2）的HMC3小胶质细胞系组成，从而能够直接比较纯神经元单培养和神经元-小胶质细胞共培养。结果表明，在接种后5周，与神经元单培养相比，NM共培养中多种神经元成熟标志物显著上调，表明在存在小胶质细胞的情况下，神经元成熟加速且更为稳健。免疫荧光分析进一步证实，NM共培养中Tuj1表达增强，且神经元网络更为复杂，网络密度和连接性更高，表明功能整合更先进。线粒体网络的互连性在视觉上也增加了。这些结果支持了小胶质细胞在协调神经元成熟和网络组装中的关键作用，可能通过营养和代谢机制实现。
2.2 小胶质细胞线粒体重编程三维人脑模型中的神经元生物能量学
为解析小胶质细胞驱动成熟的机制，接下来探究了小胶质细胞线粒体的转移是否贡献了所观察到的神经元发育。活细胞成像揭示了小胶质细胞线粒体向神经元内的动态移动，支持了细胞器转移可提供额外营养支持的可能性。假设线粒体转移本身可能是神经元成熟的关键驱动力。为确定小胶质细胞线粒体在神经元生物能量成熟中的贡献，从三维小胶质细胞单培养中分离了新鲜的小胶质细胞线粒体，并直接应用于初始的神经元培养。线粒体转移诱导了神经元代谢活性的显著改变。在处理后24小时，处理组神经元的耗氧率显著升高，表明氧化磷酸化迅速增强。这种趋势在处理后48小时持续，处理组的耗氧率与NM条件相当，表明代谢趋于稳定。到处理1周时，处理条件在所有组中表现出最高的OXPHOS活性。ECAR（细胞外酸化率）分析进一步支持了代谢转换。在处理后24小时，未处理神经元表现出升高的ECAR，表明糖酵解增强。然而，到处理后48小时，处理神经元的ECAR显著增加，与增强的糖酵解活性一致。这些效应在处理1周时消失。综合来看，这些发现表明，用小胶质细胞线粒体处理可以调节神经元生物能量学，以时间动态的方式增强氧化和糖酵解能力。这表明小胶质细胞线粒体转移可能是神经元代谢成熟的潜在调节机制。
2.3 小胶质细胞线粒体恢复神经元线粒体动力学
在NM共培养中，小胶质细胞和神经元线粒体显示出明显的共定位。尽管在处理后24小时，生物能量层面有变化，但在该时间点的蛋白质表达或线粒体健康没有显著改变。在处理后48小时，观察到了小胶质细胞线粒体整合到神经元中的视觉证据。到处理后1周，共定位趋势持续，支持了神经元内化细胞外线粒体以获取潜在代谢支持的能力。线粒体形态的定量分析显示，在处理后48小时，用微胶质细胞线粒体处理的神经元展现出显著碎片化的线粒体，与碎片化状态一致。然而，到处理后1周，处理神经元中线粒体的长宽比与NM无差异，表明线粒体形态得以恢复。相比之下，未处理神经元的长宽比显著低于处理组，表明在缺乏处理的情况下，线粒体碎片化持续存在。此外，为评估线粒体健康，检测了裂变和功能的标志物。线粒体裂变关键标志物DRP1在丝氨酸616位点的磷酸化水平在未处理神经元中显著升高。细胞内MTCO1（线粒体编码的细胞色素C氧化酶I）的表达在未处理神经元中最高，而处理后1周的神经元中MTCO1表达较NM有所增加，表明后期可能存在代偿性线粒体活性。这些数据共同表明，用微胶质细胞线粒体处理可促进其被神经元摄取，并支持改善的线粒体动力学，特别是通过减少裂变和恢复更健康的线粒体形态。
2.4 小胶质细胞的存在通过超越线粒体转移的方式增强神经发育
为研究小胶质细胞线粒体诱导的早期生物能量变化是否伴随着转录重编程，对处理后48小时的神经元进行了RNA测序。差异基因表达分析揭示了神经系统发育通路的显著富集，包括神经发生、神经系统发育和神经元分化。在处理后1周，处理神经元表现出树突成熟标志物MAP2表达的增加，证实了其在转录变化之后发生。同时，未检测到对神经元网络或神经退行性标志物的不利影响。聚焦于MitoCarta 3.0数据库中的线粒体特异性基因，发现了七个因处理而显著改变的基因。尽管ETC相关基因下调，但处理后的神经元表现出氧化代谢增加，这表明向脂肪酸氧化的代偿性转换。这些结果表明，当神经元整合细胞外线粒体时，可能伴随着减弱内源性ETC基因表达的转录重塑。
为确定线粒体转移本身是否能复制直接的神经元-小胶质细胞相互作用的效果，比较了处理后48小时与NM共培养的转录谱。虽然线粒体处理相对于未处理条件促进了神经发育基因的表达，但NM共培养在神经元生成、神经元分化和神经元发育相关通路方面表现出显著更高的表达水平，表明其具有更强健的神经源性程序。NM共培养在代谢功能视角上也优于未处理和处理条件。未处理神经元专注于基于OXPHOS的代谢，富集了异常线粒体功能通路和ETC缺陷通路。用微胶质细胞线粒体处理则将代谢从OXPHOS转向糖酵解。NM共培养更专注于蛋白质生产。总体而言，线粒体功能受处理正面影响，富集了糖酵解和蛋白质生产相关通路。然而，NM共培养允许平衡的代谢环境，并支持高效的线粒体功能。
为进一步解析超越直接线粒体转移的小胶质细胞贡献，测试了可溶性线索本身是否能影响神经元成熟。用缺乏线粒体的小胶质细胞条件培养基处理神经元，导致MAP2在48小时内迅速显著增加，表明小胶质细胞分泌因子可以在不依赖线粒体转移的情况下独立促进早期的树突发育。相比之下，突触蛋白-1水平较NM共培养降低，线粒体标志物表现出失调状态。在NM共培养中使用Rasarfin或Ciliobrevin进行多剂量抑制线粒体转移，也产生了高度相似的表型。尽管有效抑制了细胞器交换，MAP2水平反而增加，而突触蛋白-1和CX3CL1仍维持在较低水平。线粒体标志物再次向不成熟或碎片化状态转变。总的来说，这些发现表明，线粒体转移单独就能诱导神经元发生转录转换，这些转换在免疫和细胞外基质轴上与ASD生物学部分重合，同时在结构、代谢和突触程序上偏离ASD。这种选择性模式表明，小胶质细胞线粒体可以部分再现ASD相关的免疫信号，但同时促进那些对抗在ASD中被下调的通路，特别是那些与神经元成熟和线粒体功能相关的通路。这一分析强调了线粒体转移以不同于完整小胶质细胞更广泛影响的方式塑造了神经元特性，突出了其作为神经元发育的独立驱动因素的潜在机制贡献及其局限性。
2.5 小胶质细胞驱动ASD样免疫趋同，而两者在成熟和表观遗传程序上均存在偏离
最后，直接比较了处理48小时后线粒体处理神经元和神经元-小胶质细胞共培养与ASD患者皮层的RNA-seq谱。通路富集分析显示，NM在免疫和细胞外基质程序上与ASD存在对齐，包括Toll样受体信号、TNF/NF-κB信号、干扰素和细胞因子反应、Fc受体和补体相关通路、整合素-RHO细胞骨架重塑以及细胞外基质生物合成通路。这些趋同通路在ASD中主要下调，表明小胶质细胞的存在再现了该疾病特征的免疫抑制和ECM重塑模式。相比之下，线粒体处理神经元在这些模块上表现出最小的趋同，并且更接近未处理神经元，表明仅线粒体本身不足以驱动ASD样免疫对齐，反而可能赋予一定程度抵抗病理性重塑的能力。另外的分析确定了偏离ASD的通路，线粒体处理和NM条件在神经元成熟和突触程序上均偏离了患者状态，包括神经发生、突触组装和传递、囊泡循环以及轴突-树突组织。偏离在染色质调节、细胞周期模块、钙处理和线粒体生物发生与翻译方面也很明显。在ASD皮层中，这些模块被广泛下调，而两个实验条件相对于ASD上调了这些基因集，表明它们正在远离ASD状态，并部分恢复了与成熟和线粒体相关的功能。这些结果表明，小胶质细胞是驱动与ASD在免疫和细胞外基质通路上趋同的主要驱动力，而两个实验条件在神经元发育、染色质/细胞周期、钙以及线粒体生物发生/翻译方面都偏离了ASD，通过增加这些程序来部分恢复功能。线粒体处理神经元的最小免疫趋同表明，外源线粒体可能提供部分对抗ASD样转录组对齐的保护。
3 讨论
3.1 代谢重编程反映发育成熟
数据显示，外源递送小胶质细胞线粒体到神经元，可诱导代谢活性的时间性转换，这与人类神经成熟中观察到的发育转换相似。在处理后48小时，观察到OXPHOS和ECAR均恢复到与NM共培养相当的水平。到1周时，OXPHOS活性显著升高，而ECAR保持不变，表明其向有氧呼吸发生了持久的代谢重编程。这类似于在人类干细胞来源神经元中观察到的模式。这些结果与一种可能性一致，即线粒体功能有助于建立神经元代谢特征。近期的研究强调了线粒体状态和代谢重塑与人类发育的时机和进展密切相关，支持了线粒体参与调节发育节律的概念。并行地，小胶质细胞与神经元之间的代谢耦合已被证明可支持神经元功能，而隧道纳米管连接能够在压力下将健康的小胶质细胞线粒体转移给神经元。基于此框架，本研究结果表明，小胶质细胞线粒体参与了一种成熟门控的形式，即神经元线粒体的发育轨迹，进而神经元成熟，部分取决于小胶质细胞线粒体的输入。最后，在考虑如ASD等神经元发育受损的背景下，比较结果表明，线粒体驱动的成熟程序偏离了ASD相关的缺陷，而小胶质细胞依赖的免疫和ECM通路与ASD相关特征存在部分对齐。因此，结果表明，虽然健康的神经元成熟的关键机制正变得更加清晰，但小胶质细胞线粒体调节可能是理解ASD中发育轨迹改变的一个潜在途径。
3.2 转录组转换支持神经发育进展
RNA测序表明，仅线粒体处理就激活了与神经系统发育相关的转录程序子集，包括神经发生、神经元分化、投射发育以及中枢和周围神经系统形成。涉及线粒体结构和功能的基因，特别是膜结合的呼吸复合体基因，也被显著上调。这些发现与发育研究一致，表明线粒体生物发生和嵴重塑是神经谱系分化的关键驱动因素。与NM条件相比，处理神经元继续在发育通路中表现出富集，包括轴延伸和神经发生，表明线粒体转移提供了独特且持续的成熟信号。然而，当置于ASD背景下时，其意义变得更为微妙。在48小时，NM在免疫和细胞外基质轴上与ASD对齐，而线粒体处理神经元在这些通路上表现出最小的趋同。这表明，虽然完整的小胶质细胞加速了神经元成熟，但它们也可能激活了与ASD转录组数据集中报告的那些相重叠的免疫重塑程序。相比之下，线粒体处理和NM都在神经元成熟和突触程序、染色质/细胞周期模块、钙处理和线粒体生物发生/翻译方面偏离了ASD。在ASD皮层中，这些通路被广泛下调；两个实验条件相对于ASD上调了它们，表明它们正在远离ASD状态，并部分恢复了与成熟和线粒体相关的功能。线粒体转移可以影响在ASD中被改变的神经元成熟通路，同时作为更广泛的多因素小胶质细胞反应中的一个元素发挥作用。数据支持区分神经元-小胶质细胞相互作用的两个独立维度：线粒体介导的神经元代谢和转录成熟调控，以及小胶质细胞驱动的免疫和细胞外基质信号传导。这些过程似乎对发育结果有不同的贡献，表明调节线粒体输入可能独立于其他小胶质细胞功能而影响神经元成熟。证明分离的小胶质细胞线粒体足以改变神经元代谢和转录程序，将本研究结果置于一个不断增长的研究体系中，该体系探索线粒体作为神经元健康的功能性调节者。在此背景下，线粒体移植已在几种与线粒体功能障碍相关的神经元疾病中被研究。将本研究的体外功能数
