《Advanced Science》：A Tac1-Expressing Brainstem Pathway Underlies the Pathogenesis of Trigeminal Neuralgia
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本研究首次揭示了一条从外周向大脑传递疼痛信号的关键神经环路TG-Sp5CTac1-PBNTac1，它驱动了三叉神经痛（TN）的病理发生。通过整合化学遗传学、光遗传学、在体光纤记录和单细胞测序等多种技术，研究者发现表达速激肽1（Tac1）的臂旁核（PBNTac1）神经元活性在TN中显著升高，特异性抑制该神经元可有效缓解疼痛。该通路上游的延髓三叉神经脊束核尾侧亚核（Sp5C）中，向PBN投射的神经元同样高表达Tac1，是TN病理的关键环节。这项研究为深入理解面部疼痛的神经机制和开发新型靶向疗法提供了重要依据。
引言
三叉神经痛（Trigeminal Neuralgia, TN）是一种累及三叉神经分布区的、反复发作的剧烈阵发性疼痛，严重影响患者的生活质量。尽管多数患者接受药物治疗，仍有约三分之二的人持续遭受中重度疼痛，这凸显了阐明其潜在神经机制、开发新疗法的迫切临床需求。三叉神经节（TG）的感觉神经元负责检测和传递头面部区域的信号至中枢神经系统。其中，延髓三叉神经脊束核尾侧亚核（Sp5C）是口面部伤害性信息处理的中枢枢纽，它将外周信号中继至包括丘脑、下丘脑和臂旁核（PBN）在内的多个脑区。PBN是Sp5C下游的主要靶点之一，可整合来自TG的直接和间接伤害性输入，介导口面部疼痛处理。既往研究显示，在慢性眶下神经压迫（CION）诱导的TN模型中，PBN神经元表现出过度兴奋。然而，PBN内参与TN调控的特定神经元身份及其潜在机制仍不明确。在脊髓中，速激肽1（Tac1）等分子标记物已被鉴定为投射神经元的标志，并参与躯体疼痛处理。有趣的是，其中一些标记物在Sp5C中也有表达，但它们在TN发展中的功能角色尚待探索。
结果
PBNTac1神经元关键性地调控TN诱导的痛觉过敏
研究者首先利用CION手术建立了TN小鼠模型，并结合定制化的头部固定系统，系统评估了小鼠的自发性疼痛和刺激诱发的疼痛相关行为。与假手术组相比，CION组小鼠表现出更高的面部表情痛苦评分、降低的机械性撤足阈值以及缩短的热刺激撤足潜伏期，表明TN模型构建成功。
PBN作为一个异质性核团，接收来自TG的直接和间接输入。为了探究PBN在TN中的作用，研究者向野生型小鼠的右侧PBN注射了抑制性DREADD病毒（hM4Di）以化学遗传学抑制该区神经元。结果发现，在CION手术后持续抑制PBN神经元，可显著阻止TN诱导的机械性痛觉过敏。重要的是，在给予抑制剂之前（术后第7天），hM4Di组小鼠的疼痛阈值就已升高，提示PBN神经元的活动对TN诱导痛觉过敏的启动至关重要。
为了进一步明确参与TN调控的PBN神经元亚型，研究者通过RNAscope原位杂交检测了c-Fos与PBN内不同分子标记物（包括生长抑素（Sst）、速激肽受体1（Tacr1）和Tac1）的共定位情况。他们发现，在CION模型中，PBN外侧亚区（PBel）内与c-Fos共定位的Tac1阳性神经元数量显著多于假手术组，提示更多PBNTac1神经元被激活。在体光纤光度记录也证实，CION术后第14天，PBNTac1神经元对刺激诱发的反应较基线水平显著增强。
接下来，研究者在Tac1-Cre小鼠的右侧PBN特异性表达抑制性DREADD（hM4Di），以化学遗传学抑制PBNTac1神经元。结果显示，慢性抑制PBNTac1神经元可显著减轻TN诱导的痛觉过敏，表现为痛苦表情评分降低、机械撤足阈值升高以及热刺激撤足潜伏期延长。与抑制整个PBN神经元的结果类似，在给予抑制剂之前，疼痛阈值从术后第7天就开始改善，表明慢性抑制PBNTac1神经元可逆转TN诱导的神经可塑性。此外，抑制PBNTac1神经元并不影响呼吸频率，排除了镇痛效应源于呼吸状态改变的可能性。作为对照，抑制PBN内另一PBel细胞类型——Oprm1阳性神经元，则未能显著缓解TN诱导的痛觉过敏，突出了PBNTac1神经元在TN调控中的特异性作用。
投射至PBN的Sp5C神经元是TN病理所必需的
为了绘制PBN的上游环路，研究者将逆行示踪剂CTB-555注射到PBN，发现Sp5C和孤束核（NTS）存在被标记的神经元。将顺行示踪病毒AAV2/8-EGFP.PreSynapse注射到Sp5C后，在PBN和丘脑腹后内侧核（VPM）均检测到了EGFP阳性的轴突末梢，证实Sp5C是PBN的上游区域之一。
电生理记录结合光遗传学刺激进一步确认了Sp5C与PBNTac1神经元之间的功能连接。在Sp5C表达ChR2并在PBNTsup>1神经元标记EYFP后，研究者记录到PBNTac1神经元可被蓝光诱发内向电流。该电流可被AMPA/NMDA受体拮抗剂NBQX/AP5阻断，表明是兴奋性突触后电流（EPSC）。虽然也记录到少量抑制性突触后电流（IPSC），但其幅度和连接比例远低于兴奋性连接，且两者的抖动分析均表明为单突触连接。进一步用河豚毒素（TTX）和4-氨基吡啶（4-AP）验证，确认了兴奋性连接的单突触性质。这些结果表明，Sp5C神经元主要向PBNTac1神经元发送单突触兴奋性投射。
在体行为学实验表明，化学遗传学抑制整个Sp5C区的神经元，可显著缓解CION诱导的痛觉过敏。为了更精确地研究投射至PBN的Sp5C亚群，研究者通过逆行病毒标记PBN投射的Sp5C神经元，并记录其在CION术后的神经可塑性变化。结果显示，与假手术组相比，CION组PBN投射Sp5C神经元的自发兴奋性和抑制性突触后电流频率均显著增加，表明TN诱导了更复杂的突触前输入变化。
在体光纤光度记录显示，CION术后，Sp5C-PBN通路对刺激诱发的反应显著增强，而在假手术组则无此现象。研究者进一步特异性抑制PBN投射的Sp5C神经元，发现同样可显著减轻CION诱导的痛觉过敏，且疼痛缓解在抑制剂给予前（术后第3天）就已出现，提示仅抑制该投射神经元两天就足以阻断TN痛觉过敏的发展。相反，光遗传学激活Sp5C-PBN通路，则足以诱导自发性疼痛相关的擦拭行为、降低机械痛阈，并引发一定的条件性位置回避，证明该通路在口面部疼痛处理中具有充分性。
投射至PBN的Sp5C神经元主要为Tac1阳性
为鉴定PBN投射Sp5C神经元的分子标记，研究者对逆行病毒标记的该群神经元进行了单细胞测序。分析发现，这些神经元主要表达兴奋性神经元标记Slc17a6，而在一系列候选标记基因中，Tac1的表达水平显著高于其他基因，并且在26个被测序神经元中的23个呈高表达，强烈提示Tac1是PBN投射Sp5C神经元的特异性标记。
进一步的神经束路追踪实验证实，在Tac1-Cre小鼠的Sp5C表达EYFP，可在PBN检测到密集的EYFP阳性纤维；而在Tacr1-FLPo、Pdyn-Cre或Nmur2-Cre小鼠中，PBN内则鲜有相应纤维。反之，将逆行依赖Cre的病毒注射到PBN，可在Sp5C标记到Tac1阳性神经元。这些结果共同表明，PBN主要接收来自Sp5CTac1神经元的投射。
利用狂犬病毒介导的跨单突触逆行示踪，研究者确认PBNTac1神经元接收来自Sp5CTac1神经元的直接输入。电生理记录进一步证明，Sp5CTac1神经元与PBNTac1神经元之间存在单突触兴奋性连接。更重要的是，与假手术组相比，CION组中这两个神经元群体之间的连接比例显著增加，提示该Sp5CTac1-PBNTac1通路的参与在TN中增强。
Sp5CTac1-PBN通路在TN调控中起关键作用
RNAscope实验显示，在Sp5C浅层，CION组Tac1阳性神经元中c-Fos阳性的比例显著高于假手术组，表明更多Sp5CTac1神经元在TN模型中被激活。化学遗传学抑制Sp5CTac1神经元可缓解TN痛觉过敏，但效果不如特异性抑制PBN投射的Sp5CTac1神经元持久，提示Sp5CTac1神经元的异质性。
电生理记录发现，与假手术组相比，CION组PBN投射的Sp5CTac1神经元的自发兴奋性突触后电流频率显著增加，而抑制性电流频率无变化，表明TN特异性地增强了该群神经元的兴奋性输入。在体光纤记录也证实，CION术后，Sp5CTac1-PBN通路的刺激诱发反应显著增强。
通过在PBN局部灌注抑制剂，特异性抑制Sp5CTac1-PBN通路的轴突末梢，可减轻TN痛觉过敏，但给药前无镇痛效应，提示轴突抑制不足以逆转TN诱导的PBN投射Sp5CTac1神经元的可塑性。另一方面，光遗传学特异性激活Sp5CTac1-PBN通路，足以诱发自发性擦拭行为、降低机械痛阈，并引起显著的条件性位置回避，证明该通路是驱动口面部疼痛相关行为的充分条件。
PBN投射Sp5C神经元中的Tac1基因调控TN发展
Tac1基因编码的P物质（SP）是一种与疼痛调制相关的神经肽。研究者在Cas9小鼠中，利用CRISPR-dCas9系统，特异性敲低PBN投射Sp5C神经元中的Tac1基因。验证显示，sgTac1组感染神经元中Tac1阳性比例及Tac1 mRNA水平均显著低于对照组，表明敲低有效。行为学测试发现，敲低该基因并不影响急性口面部伤害性感受，但可显著减轻CION诱导的痛觉过敏，表明PBN投射Sp5C神经元中的Tac1基因对TN发展至关重要。进一步实验排除了该操作对梳理行为的影响。
通过对假手术和CION组小鼠PBN投射Sp5CTac1神经元的转录组测序，研究者鉴定出275个差异表达基因（63个上调，212个下调）。这些基因与疼痛、神经元兴奋性和突触传递等功能相关，如胃泌素释放肽（Grp）、血管活性肠肽（Vip）、神经肽Y（Npy）以及多个钾通道基因等。蛋白互作网络和功能富集分析表明，这些差异基因参与了神经肽激素活性、电压门控钾通道活性等通路，揭示了CION诱导的转录重编程，为理解TN病理的分子机制提供了线索。
Sp5CTac1神经元直接中继TG信号至PBN
通过狂犬病毒跨单突触示踪，研究者证实PBN投射的Sp5CTac1神经元接收来自TG的直接单突触输入。对病毒标记的TG神经元进行免疫组化分型发现，它们部分与伤害性标记物CGRP、SCN11A、IB4及非伤害性标记物NF200共标，表明TG向该通路传递了伤害性和非伤害性信号。
电生理记录结合光遗传学验证了TG与PBN投射Sp5CTac1神经元之间存在功能性的单突触兴奋性连接。最后，研究者特异性化学遗传学激活接收TG输入的Sp5CTac1神经元，可剂量依赖性地诱导机械性痛觉过敏、热痛觉过敏以及自发性疼痛行为，证明TG靶向的Sp5CTac1神经元足以驱动伤害性行为。
讨论
本研究鉴定了一条细胞类型特异性的Sp5CTac1-PBNTac1通路，该通路关键性地调控TN诱导的口面部痛觉过敏。研究扩展了PBNTac1神经元在三叉神经疼痛系统内的功能。
在Sp5C层面，本研究发现Tac1（而非Tacr1）是PBN投射神经元的主要分子标记，这不同于脊髓投射神经元的情况，提示躯体与口面部疼痛处理存在根本不同的机制。Tac1基因编码的SP在该通路中起关键作用，其机制可能通过作用于PBN内的星形胶质细胞、小胶质细胞或突触前末梢上的NK1R来影响PBNTac1神经元。对PBN投射Sp5CTac1神经元的转录组分析，为开发靶向性新疗法揭示了有前景的候选通路。
在PBN层面，研究发现位于PBel的Tac1阳性神经元（而非Oprm1阳性神经元）在TN调制中起关键作用。这与位于背外侧PBN（PBdl）的Tacr1神经元在躯体疼痛处理中的作用形成对比，进一步支持了躯体与面部疼痛涉及不同PBN细胞类型的观点。PBel和PBdl具有截然不同的全脑投射模式，也暗示了两者可能存在不同的环路机制。
关于输入通路，PBNTac1神经元主要接收来自Sp5C的间接TG输入，而非直接TG输入。在TN模型中，该间接通路的兴奋性输入和连接性均增强，表现出可塑性变化。虽然直接的TG-PBN通路可能参与口面部疼痛相关情绪处理，但本研究聚焦的间接通路在TN感觉过敏中扮演了核心角色。
综上所述，本研究系统阐释了驱动TN的特定外周-脑干神经环路，揭示了Tac1阳性神经元在该通路中的核心作用，为理解口面部疼痛的特异性机制和开发精准治疗策略奠定了坚实基础。
