大分割放疗诱导的ISG15+MHC-I+中性粒细胞重塑肿瘤免疫微环境并增强直肠癌免疫治疗响应

《Advanced Science》：Hypofractionated Radiotherapy Induces ISG15+MHC-I+ Neutrophils to Augment Anti-Tumor Immunity and Prime Immune Checkpoint Blockade Responses in Rectal Cancer

本研究揭示了大分割放疗(HFRT)在局部晚期直肠癌(LARC)治疗中发挥抗肿瘤作用的新机制。研究发现HFRT通过诱导IFN-α的释放，激活NOD1/NF-κB信号轴，驱动中性粒细胞分化为具有抗原呈递能力的ISG15+MHC-I+亚群。该新型中性粒细胞不仅能有效激活CD8+T细胞，还与免疫检查点阻断(ICB)治疗产生协同效应，显著抑制肿瘤生长。这一发现为理解放疗与免疫治疗的协同作用提供了关键分子与细胞基础，并为克服微卫星稳定(MSS)型直肠癌的免疫治疗耐药性提供了新策略。

　　

在肿瘤免疫学领域，中性粒细胞的功能一直颇具争议，传统上被认为是先天免疫的“快速反应部队”，寿命短且功能单一。然而，近年来研究发现，在复杂的肿瘤微环境(TME)中，中性粒细胞展现出惊人的可塑性和异质性，既能促进肿瘤进展，也能发挥抗肿瘤作用。局部晚期直肠癌(LARC)是常见的消化道恶性肿瘤，其中绝大多数(约95%)为微卫星稳定(MSS)型，对免疫检查点抑制剂(ICB)如抗PD-1疗法反应不佳，被视为“冷”肿瘤。因此，寻找将“冷”肿瘤转化为“热”肿瘤的策略，是提高LARC免疫治疗疗效的关键。本研究聚焦于大分割放疗(HFRT)这一临床新策略，旨在揭示其如何重塑肿瘤免疫景观，特别是如何“教育”中性粒细胞，使其成为连接局部放疗与全身性抗肿瘤免疫的桥梁。

大分割放疗重塑局部晚期直肠癌中的中性粒细胞亚群

研究团队首先通过单细胞RNA测序(scRNA-seq)分析了接受HFRT联合免疫治疗的LARC患者的肿瘤组织。他们发现了55,037个高质量细胞，并鉴定出16个不同的细胞簇。与治疗前相比，治疗后样本中B细胞、中性粒细胞、调节性T细胞(Treg)等免疫抑制性细胞比例下降，而细胞毒性CD8⁺T细胞、浆细胞和单核细胞则显著扩增，表明HFRT能够全面重塑LARC的局部免疫景观。

进一步对中性粒细胞亚群的分析揭示了四个功能各异的亚群：C1_S100A12⁺、C2_ISG15⁺MHC-I⁺、C3_CXCL8⁺和C4_SPP1⁺。其中，C2_ISG15⁺MHC-I⁺中性粒细胞的特征是高表达干扰素应答基因(如ISG15)和主要组织相容性复合体I类(MHC-I)分子(如HLA-A, HLA-B, HLA-C)。值得注意的是，在治疗后，具有免疫抑制特征的S100A12⁺和SPP1⁺亚群比例下降，而免疫刺激性的ISG15⁺MHC-I⁺和CXCL8⁺亚群显著增加。伪时间轨迹分析提示，ISG15⁺MHC-I⁺中性粒细胞处于中间分化阶段，可能由较不成熟的S100A12⁺亚群分化而来，并最终可能向终末的SPP1⁺亚群发展。更重要的是，只有在达到病理完全缓解(pCR)的患者中，ISG15⁺MHC-I⁺中性粒细胞的比例在HFRT后才显著增加，提示其与良好疗效密切相关。

ISG15⁺MHC-I⁺中性粒细胞展现出强大的免疫刺激能力以激活CD8⁺T细胞反应

基因本体(GO)通路富集分析显示，ISG15⁺MHC-I⁺中性粒细胞在“抗原加工与呈递”和“对IFN-α的应答”通路上显著富集。功能谱分析也证实，该亚群具有较低的促肿瘤通路活性和较高的干扰素信号活性。相反，CXCL8⁺中性粒细胞则在促血管生成和免疫抑制方面活性更高。对癌症基因组图谱(TCGA)数据库中放疗后LARC组织的分析进一步证实，高水平的ISG15⁺MHC-I⁺中性粒细胞与更好的患者预后相关，而CXCL8⁺中性粒细胞则预示着较差的结局。

为了探究ISG15的作用机制，研究人员发现重组ISG15蛋白对肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭没有直接影响。然而，在体内使用SARS-CoV-2 PLpro(SCP)特异性抑制ISG15的活性(ISGylation)后，肿瘤进展加速，且肿瘤内CD8⁺T细胞和产生IFN-γ的细胞毒性T细胞数量减少。重要的是，当同时使用抗Ly6G脂质体清除中性粒细胞后，SCP的这种促瘤效应被完全消除，证明ISG15的抗肿瘤作用依赖于中性粒细胞。在机制上，ISGylation促进了小鼠原代中性粒细胞中MHC-I的表达。

放疗后ISG15⁺MHC-I⁺中性粒细胞的诱导依赖于IFN-α

对患者血清细胞因子的分析发现，仅在pCR患者中，HFRT后IFN-α水平选择性显著升高，而IFN-β和IFN-γ无变化。在小鼠皮下肿瘤模型中，放疗显著抑制了肿瘤生长，但这种抗肿瘤效应可被IFN-α与其受体IFNAR相互作用的抑制剂部分抵消。流式细胞术分析显示，放疗强烈诱导了肿瘤内ISG15⁺MHC-I⁺中性粒细胞的积累，而阻断IFN-α–IFNAR信号则会减弱这种富集。体外实验也证实，用放疗条件培养基(RTCM)或IFN-α刺激，可强力诱导原代小鼠中性粒细胞表达ISG15。此外，放疗还显著增强了这些中性粒细胞的活性氧(ROS)产生能力，而抑制IFN-α/IFNAR信号则大幅削弱了ROS的释放。这些结果确立了HFRT通过激活IFN-α信号通路来促进ISG15⁺MHC-I⁺中性粒细胞生成。

ISG15⁺MHC-I⁺中性粒细胞通过增强的抗原呈递功能激活CD8⁺T细胞

尽管历史上认为中性粒细胞是弱的抗原呈递细胞，但本研究提供了强有力的证据表明ISG15⁺MHC-I⁺中性粒细胞具备强大的抗原呈递能力。经IFN-α或RTCM“教育”后，该亚群在转录和蛋白水平上均显著上调了MHC-I及抗原加工相关酶的表达。

+MHC-I⁺neutrophils activate CD8⁺T cells through enhanced function of antigen-presenting. (a) Relative RNA expression of MHC-I genes of HL60 with different treatment groups. (b) Relative RNA expression of antigen processing protease genes of the primary neutrophil with different treatment groups. (c) The expression of MHC class I of the primary neutrophil in protein level by using Western Blot. (f) Neutrophil treated with RT conditioned medium from MC38 cells were directly or indirect co-cultured with primary CD8⁺T cells. CD8⁺T cell proliferation was measured by CFSE dilution.">

单细胞互作分析显示，CD8⁺T细胞与中性粒细胞之间存在最强的双向信号交流，且在HFRT后这种交流显著增强。配体-受体分析进一步确定了中性粒细胞来源的MHC-I分子与T细胞表达的CD8α之间的强相互作用。功能上，体外诱导的ISG15⁺MHC-I⁺中性粒细胞与原发性CD8⁺T细胞直接共培养时，能显著激活T细胞增殖，且这种激活是接触依赖性的。这些中性粒细胞还表现出更强的抗原摄取和呈递能力。在OVA抗原存在的情况下，它们能有效激活OT1小鼠来源的T细胞，证明其通过抗原呈递激活T细胞。与通用的T细胞刺激剂共培养时，ISG15⁺MHC-I⁺中性粒细胞能强力激活CD8⁺T细胞，诱导高水平的效应分子(如IFN-γ)和细胞毒性分子(如颗粒酶B, GZMB)表达。

IFN-α通过NOD1/NF-κB信号触发MHC-I启动子结合以诱导ISG15⁺MHC-I⁺中性粒细胞

为了阐明HFRT或IFN-α介导中性粒细胞表型重塑的通路，研究人员对RTCM诱导的ISG15⁺MHC-I⁺中性粒细胞进行了转录组测序。京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析表明，NOD1、JAK和NF-κB信号通路在该亚群中均上调。Western blot进一步证实了NOD1、磷酸化p65(Ser536)和JAK1蛋白水平的显著升高。

+MHC-I⁺Neutrophils via Direct MHC-I Promoter Binding. (b) KEGG analysis of differentially expressed genes between ISG15-induced group and control group. (c) Western blotting for the expression of MHC class I in the primary neutrophil and IFN-α induced ISG15⁺MHC-I⁺neutrophils. (d) Western blotting for the expression of MHC class I, NOD1, p-p65, and p65 in the primary neutrophil, ±IFN-α-IFNAR-IN-1 hydrochloride. (e) Western blotting for the expression of MHC class I, NOD1, p-p65, and p65 in the primary neutrophil, ±NLRP3-IN-32.">

机制上，使用IFN-α/IFNAR抑制剂可有效抑制RTCM或IFN-α刺激引起的中性粒细胞内NOD1、p-p65和MHC-I的上调。随后特异性抑制NOD1同样降低了MHC-I和p-p65的表达，而抑制JAK1则无此效果，表明IFN-α主要通过NOD1依赖的信号而非JAK1来调节下游NF-κB活性和MHC-I表达。药理学抑制NF-κB信号可显著降低p-p65水平和相应的MHC-I表达。生物信息学分析揭示了MHC-I启动子区存在一个NF-κB结合峰，染色质免疫沉淀(ChIP)-qPCR实验证实NF-κB可特异性结合到该位点，从而直接上调MHC-I的转录。这些发现共同确立了HFRT通过激活IFN-α/NOD1/NF-κB信号级联来驱动ISG15⁺MHC-I⁺中性粒细胞的生成。

过继性回输ISG15⁺MHC-I⁺中性粒细胞抑制肿瘤生长并与免疫疗法产生协同效应

研究进一步探索了过继性回输该中性粒细胞亚群的治疗潜力。从小鼠骨髓分离中性粒细胞，用RTCM或IFN-α刺激后，通过尾静脉回输至荷瘤小鼠体内。结果显示，回输ISG15⁺MHC-I⁺中性粒细胞能显著抑制肿瘤生长，并增强肿瘤内CD8⁺T细胞的浸润及其产生IFN-γ的效应功能。重要的是，在回输前清除CD8⁺T细胞，会完全消除过继性回输带来的肿瘤抑制效果，证明其抗肿瘤活性依赖于完整的T细胞免疫。

+MHC-I⁺neutrophils Suppresses Tumor Growth In Vivo. (a) Schematic diagram of the MC38 subcutaneous tumor mouse model. (b) Representative images of tumors in mice treated as described above. (c) Tumor growth of MC38 tumor-bearing C57BL/6 mice treated with the indicated treatments. (d) Tumor weights in mice treated as described above. (e) Representative flow plot and percentages of CD8⁺T cells in tumor tissue. (f) Representative flow plot and percentages of IFN-γ⁺CD8⁺T cells in tumor tissue.">

更有前景的是，将过继性回输ISG15⁺MHC-I⁺中性粒细胞与抗PD-1疗法联合，在小鼠模型中显示出协同抑制肿瘤生长的效应。联合治疗组肿瘤内CD8⁺T细胞的浸润以及产生IFN-γ的CD8⁺T细胞比例均得到协同性增强。

+MHC-I⁺Neutrophils Exerts Synergistic Antitumor Effects with Immunotherapy. (a) Schematic diagram of MC38 subcutaneous tumor mouse model. (b) Representative images of tumors in mice treated as described above. (c) Tumor growth of the MC38 tumor-bearing C57BL/6 mice treated with the indicated treatments. (d) Tumor weights in mice treated as described above. (e) Representative flow plot and percentages of CD8⁺T cells in tumor tissue. (f) Representative flow plot and percentages of IFN-γ⁺CD8⁺T cells in tumor tissue.">

ISG15⁺MHC-I⁺中性粒细胞浸润增加与局部晚期直肠癌新辅助治疗疗效相关

最后，研究在一个包含40名LARC患者的回顾性队列中验证了该发现的临床相关性。通过多重免疫组化分析发现，新辅助治疗后，肿瘤组织中ISG15⁺MHC-I⁺中性粒细胞的密度显著增加，且在达到pCR的患者中密度更高。重要的是，该亚群密度的增加仅出现在pCR患者中，非pCR患者中则无明显变化。这一结果在患者外周血样本的流式细胞术分析中得到了独立验证。多因素Cox回归分析进一步表明，HFRT后外周血中高水平的ISG15⁺MHC-I⁺中性粒细胞与获得pCR的概率显著正相关。因此，ISG15⁺MHC-I⁺中性粒细胞有望成为预测LARC患者对放疗和免疫治疗响应的潜在生物标志物。

综上所述，这项研究揭示了HFRT在LARC中诱导产生一种独特的功能性中性粒细胞亚群——ISG15⁺MHC-I⁺中性粒细胞。该亚群通过IFN-α/NOD1/NF-κB信号轴获得强大的抗原呈递能力，从而有效激活CD8⁺T细胞免疫应答，并与免疫检查点阻断疗法产生协同抗肿瘤效应。这一发现不仅阐明了放疗与免疫治疗协同作用的新细胞与分子机制，为克服MSS型直肠癌的免疫治疗耐药提供了全新的思路和潜在的治疗靶点，也为开发基于中性粒细胞的过继性细胞疗法奠定了理论基础。