《Advanced Science》：Biomimetic Ru-Mn Nanozyme with Cascade Catalytic Activity Attenuates Secondary Brain Injury in Intracerebral Hemorrhage
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本文研究开发了一种新型仿生钌-锰复合纳米酶（Ru@Mn-ZIF），该纳米酶整合了钌纳米酶与锰掺杂沸石咪唑酯骨架（Mn-ZIF），具备级联催化活性，可高效清除活性氧（ROS），从而在脑出血（ICH）模型中有效减轻神经炎症、保护血脑屏障完整性、减少神经元损伤并改善神经功能恢复。研究为治疗ICH这一高致死率卒中亚型提供了有前景的新策略。
1. 引言
脑出血（ICH）是一种严重的卒中亚型，其全球年新发病例数约占2000万卒中病例的20%。高死亡率和不良预后给社会及患者家庭带来了沉重负担。ICH的病理生理学包括血肿形成引起的初始机械损伤以及数小时至数天后触发的继发性损伤级联反应。后者由红细胞裂解、神经炎症激活和细胞因子释放所驱动，共同导致神经炎症、氧化应激、血脑屏障（BBB）破坏、脑水肿和神经元损伤。其中，氧化应激是ICH诱导继发性脑损伤的核心机制。大脑的高脂质含量、高铁水平和有限的抗氧化能力使其对氧化应激尤为敏感。过度的氧化应激会加剧神经炎症、促进神经元死亡并损害BBB完整性，形成继发性脑损伤的恶性循环。因此，针对ICH后氧化应激的机制和干预研究是一个有希望的治疗方向。
纳米酶是一类新兴的仿生纳米材料，因其在神经疾病中的治疗潜力而受到广泛关注。这些人工酶在结构和功能上模拟天然氧化还原酶，如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）和氧化酶（OXD），具有高稳定性、持续催化活性和多功能酶样特性。近年来，具有SOD样或CAT样活性的锰（Mn）基、铈（Ceria）基和钌（Ru）基纳米酶已被证明可通过清除ROS有效缓解氧化应激。双金属纳米酶通过解决单金属系统催化效率不足和酶活性单一等关键限制，提供了更具前景的治疗策略。它们具有更高的稳定性、更广泛的环境适应性和可编程的治疗诊断功能，使其成为有效干预神经疾病的强大平台。
本研究受天然Mn-SOD启发，开发了一种新型仿生锰掺杂沸石咪唑酯框架（Mn-ZIF）纳米酶。为克服单一酶活性的限制，将钌纳米酶整合到多孔骨架中，以实现级联催化。该级联反应能将过氧化氢完全转化为氧气和水，显著增强自由基清除能力。得益于这一设计，新型复合Ru@Mn-ZIF纳米酶显著促进了ICH后的ROS清除，调节了小胶质细胞介导的神经炎症反应，从而减轻了继发性脑损伤，最终改善了神经功能。
2. 结果与讨论
2.1 Ru@Mn-ZIF纳米酶的构建与表征
透射电子显微镜（TEM）图像显示，所制备的Ru@Mn-ZIF纳米粒子呈均匀的中空八面体构型，平均尺寸为450纳米。扫描电子显微镜（SEM）图像和元素映射分析进一步证实了Ru(0)纳米粒子的存在。粉末X射线衍射（PXRD）分析表明，样品的衍射图与标准ZIF-8（JCPDS no. 00-062-1030）匹配良好，表明Ru对ZIF-8的骨架结构影响可忽略。然而，与标准ZIF-8相比，纳米结构的主要衍射峰向更高的角度发生了明显偏移，这可能是由于Mn2+的离子半径（0.061 nm）小于Zn2+（0.074 nm），从而证实Mn2+离子成功进入了ZIF-8的间隙位点。
X射线光电子能谱（XPS）分析揭示了表面化学环境和键合结构。Ru 3p谱显示结合能带中心位于约463.6 eV和485.5 eV，可解卷积为归属于Ru0和Ru6+物种的峰，其摩尔比约为7:3。Mn 2p谱显示结合能带位于约640.9 eV和653.4 eV，分别对应于Mn 2p3/2和Mn 2p1/2。解卷积后表明存在Mn2+和Mn4+，其摩尔比约为4:1。综合SEM、TEM、元素映射、PXRD和XPS结果，证实成功制备了Ru@Mn-ZIF纳米结构。
2.2 Ru@Mn-ZIF纳米酶的酶样活性
成功合成后，研究人员深入探索了其体外抗氧化能力。Ru@Mn-ZIF纳米酶在中性条件下表现出多种酶样活性。鉴于超氧阴离子是炎症性疾病中过量产生的一种ROS，评估纳米酶是否具有超氧化物歧化酶（SOD）模拟酶活性至关重要。通过黄嘌呤氧化酶法表征，Ru@Mn-ZIF纳米酶表现出显著的SOD样酶活性。与纯ZIF和Mn-ZIF相比，Ru的引入使SOD样酶活性分别提高了19.8倍和20.8倍，表明Ru是Ru@Mn-ZIF纳米酶的活性中心。
此外，通过ABTS和DPPH清除实验评估了纳米酶清除氧和氮自由基的能力。结果表明，在200 μg/mL浓度下，对1 mg/mL ABTS的清除率可达80%，而对DPPH的清除率约为20%。这些发现强调了Ru@Mn-ZIF纳米酶有效中和自由基的潜力。同时，在磷酸盐缓冲液（pH 6.8）中，纯ZIF、Mn-ZIF和Ru@Mn-ZIF纳米酶均表现出过氧化氢酶（CAT）样活性，可有效分解过氧化氢为氧气。与SOD样酶活性结果类似，Ru@Mn-ZIF的CAT样活性也显著优于纯ZIF和Mn-ZIF。研究人员推测，这种差异可能归因于Ru和Mn之间的电子转移，从而增强了Ru@Mn-ZIF纳米酶清除氧和羟自由基的能力，进而增强了其整体抗氧化活性。总而言之，尽管Ru@Mn-ZIF纳米酶的活性与天然酶活性存在显著差异，但这些结果表明，所合成的纳米酶具有多种酶活性，使其成为抗炎和抗氧化治疗的有希望的候选者。
2.3 纳米酶在体外减轻脂多糖（LPS）诱导的小胶质细胞氧化应激和促神经炎症
小胶质细胞是ICH后介导神经炎症的主要效应细胞，在损伤后迅速被激活。渗入大脑的血液成分和红细胞降解产物作为刺激物，在ICH急性期驱动小胶质细胞向促炎表型极化，并促进过量ROS产生。反过来，ROS进一步放大促炎激活，形成神经炎症和氧化应激的恶性循环，加剧继发性脑损伤。
为在体外模拟此状况，用促炎剂LPS刺激BV2小胶质细胞，以诱导促炎和氧化表型，从而评估纳米酶在神经炎症条件下的抗氧化特性。细胞活性（CCK-8）检测显示，在测试浓度范围（3.125-100 μg/mL）内，两种纳米酶均表现出可忽略的细胞毒性。基于此，选择25和50 μg/mL浓度进行后续实验。在LPS暴露诱导氧化应激前，用纳米酶预处理BV2细胞6小时。结果显示，纳米酶预处理显著降低了细胞内ROS水平，且Ru@Mn-ZIF纳米酶比Mn-ZIF纳米酶表现出更强的ROS清除效果。
接着，通过流式细胞术检测小胶质细胞促炎表面标志物CD86的表达。LPS刺激显著增加了BV2细胞上CD86的表达，而纳米酶预处理6小时则显著降低了CD86的表达。值得注意的是，与Mn-ZIF纳米酶相比，Ru@Mn-ZIF纳米酶在浓度依赖性方式下产生了更大的CD86水平降低。为进一步评估Ru@Mn-ZIF纳米酶抑制小胶质细胞促炎激活的能力，通过实时定量PCR（qPCR）测量了IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表达。LPS刺激强烈上调了这些促炎细胞因子的转录，而纳米酶预处理显著抑制了它们的表达。与ROS清除和抗促神经炎症结果一致，Ru@Mn-ZIF纳米酶在浓度依赖性方式下比Mn-ZIF纳米酶产生了更大的抑制效果。
2.4 纳米酶在体外减轻过氧化氢（H2O2）诱导的神经元氧化应激和死亡
ICH发生时，神经元因脑实质内的突发占位效应而遭受不可逆的损伤。幸存的神经元在血肿周围微环境中进一步暴露于氧化应激和促炎性损伤。为评估纳米酶在氧化损伤下对神经元的直接神经保护和抗氧化作用，用代表性ROS H2O2暴露HT22海马神经元细胞，建立氧化损伤模型。CCK-8检测显示，用Mn-ZIF或Ru@Mn-ZIF纳米酶处理HT22细胞24小时，在浓度高达100 μg/mL时，细胞活性保持在80%以上。基于这些发现，选择25和50 μg/mL浓度进行后续实验。用纳米酶预处理HT22细胞6小时，在暴露于H2O224小时后，细胞活性显著增加。
为直接评估纳米酶在氧化应激下对细胞内ROS水平的影响，通过荧光显微镜和流式细胞术对DCF标记的ROS进行定量。Mn-ZIF和Ru@Mn-ZIF纳米酶均显著降低了H2O2暴露的HT22细胞内的ROS水平，且Ru@Mn-ZIF纳米酶表现出更优的ROS清除能力。此外，使用碘化丙啶（PI）染色结合流式细胞术评估氧化应激条件下的神经元死亡。纳米酶预处理以浓度依赖的方式显著减少了H2O2诱导的神经元死亡。流式细胞术分析显示，H2O2刺激的细胞中PI染色呈双峰分布，对应于早期和晚期凋亡神经元的不同群体，而纳米酶处理减轻了这种效应。与ROS清除结果一致，Ru@Mn-ZIF纳米酶比Mn-ZIF纳米酶发挥了更强的神经保护作用。2O2-induced oxidative stress and neuronal death in HT22 cells. (A) CCK-8 assay of HT22 cell viability after 24 h treatment with different concentrations of nanozyme (n = 6). (B) Cell viability of HT22 neurons pretreated with nanozyme for 6 h followed by 2 h exposure to H2O2. Ru@Mn-ZIF nanozyme markedly improved neuronal survival compared with Mn-ZIF nanozyme (n = 6). (C, D) Fluorescence microscopy images of DCF staining in HT22 cells (Scale bars: 100 μm) and quantitative analysis of the DCF fluorescence intensity. Nanozyme pretreatment significantly attenuated H2O2-induced intracellular ROS level (n = 4). (E, F) Flow cytometric quantification of DCF-labeled intracellular ROS in HT22 cells. Nanozyme pretreatment significantly decreased H2O2-induced ROS accumulation (n = 4). (G, H) Flow cytometric analysis of PI staining showing that nanozyme pretreatment significantly reduced H2O2-induced neuronal death (n = 4). Data are presented as mean ± SEM and analyzed by one-way ANOVA followed by Tukey's post-hoc test. *p < 0.05, p < 0.01,p < 0.001,***p < 0.0001.">
2.5 不同给药途径的纳米酶在胶原酶诱导的ICH小鼠中减轻血肿体积和BBB渗漏并改善神经功能
为评估纳米酶通过不同给药途径的治疗效果，建立了胶原酶诱导的ICH小鼠模型，并在模型诱导后1小时通过鼻内或静脉内给药纳米酶。对神经学表现和组织病理学变化进行了全面评估。
鼻内给药是一种无创途径，允许药物通过嗅黏膜绕过BBB直接进入大脑。结果显示，鼻内给药纳米酶在ICH后第3天显著降低了同侧大脑半球的脑血红蛋白含量和伊文思蓝外渗。与Mn-ZIF纳米酶相比，Ru@Mn-ZIF纳米酶进一步减少了血肿体积和BBB渗漏。一致地，H&E染色显示纳米酶治疗后血肿周围区域炎症细胞浸润减少，并伴有大量吞噬细胞吞噬红细胞。鼻内纳米酶给药也显著逆转了ICH诱导的体重减轻。神经学结果随时间逐渐改善，改良Garcia评分和平衡木评分更高，转向偏差减少。与生理盐水（NS）组相比，纳米酶治疗显著改善了神经功能，且Ru@Mn-ZIF纳米酶比Mn-ZIF纳米酶表现出更优的疗效。
为进一步评估组织病理学变化，在ICH后第7天对血肿周围脑组织进行了多种染色。纳米酶治疗显著减少了胶质瘢痕形成。Perls普鲁士蓝染色证实铁沉积显著减少，而Luxol快蓝染色显示血肿周围白质髓鞘丢失减轻。值得注意的是，与Mn-ZIF纳米酶相比，Ru@Mn-ZIF纳米酶提供了更强的神经保护。
静脉注射是一种临床常见的给药途径，也在ICH小鼠中进行了评估。静脉注射纳米酶在ICH后第3天显著减少了血肿体积和BBB破坏，并减轻了血肿周围炎症和脑水肿等病理特征。体重和神经功能分析表明，静脉注射Mn-ZIF纳米酶比鼻内给药提供的功能改善较少，而静脉注射Ru@Mn-ZIF纳米酶在改善神经功能缺损方面表现出强大的疗效。第7天的组织病理学评估进一步证明，静脉纳米酶治疗减轻了ICH小鼠的胶质瘢痕形成、铁沉积和髓鞘丢失。
总之，这些发现表明，无论给药途径如何，Ru@Mn-ZIF纳米酶在减轻血肿负荷、保护BBB完整性和改善神经功能结局方面均优于Mn-ZIF纳米酶，从而支持了其未来转化应用的潜力。
2.6 纳米酶治疗减少ICH小鼠炎症细胞浸润和激活并抑制促炎细胞因子释放
为进一步评估纳米酶治疗对ICH神经炎症的疗效，通过免疫荧光和免疫组化检测了ICH后第3天血肿周围脑组织中炎症细胞的浸润和激活。在NS组中观察到星形胶质细胞（GFAP）和小胶质细胞（Iba-1）的强烈激活，同时在血肿周围和病灶内区域观察到强烈的MPO阳性荧光信号，表明中性粒细胞浸润。定量分析显示，鼻内纳米酶治疗显著减少了星形胶质细胞和小胶质细胞的激活以及中性粒细胞浸润。在静脉注射纳米酶的ICH小鼠中也观察到了相似的治疗效果。
在ICH急性期，活化的炎症细胞释放大量促炎细胞因子，如IL-1β、IL-6和TNF-α，进一步加重脑损伤。为评估细胞因子释放，在ICH后第3天收集的血肿周围组织上进行了免疫组化。在NS组中检测到大量促炎细胞因子，而鼻内纳米酶治疗显著降低了细胞因子表达。在静脉给药组中也观察到了一致的结果。重要的是，无论给药途径如何，Ru@Mn-ZIF纳米酶在减少炎症细胞浸润和激活以及抑制促炎细胞因子释放方面均比Mn-ZIF纳米酶表现出更大的疗效。
2.7 纳米酶治疗增加存活神经元数量并减轻ICH小鼠氧化应激诱导的神经元损伤
基底神经节是原发性ICH最常见的部位，鉴于其在体感和运动通路中作为关键中继站的作用，该区域的神经元存活构成了ICH后功能恢复的结构基础。为评估纳米酶治疗对纹状体神经元的神经保护作用，进行了尼氏染色以评估血肿周围神经元密度。鼻内给予Ru@Mn-ZIF纳米酶显著增加了神经元密度。相关性分析进一步证明，血肿周围神经元密度与平衡木评分和改良Garcia评分呈显著正相关，而与右转百分比呈负相关。这些发现为观察到的Ru@Mn-ZIF纳米酶治疗显著改善神经功能提供了证据解释。在静脉给药治疗的ICH小鼠中也观察到了一致的结果。
与此同时，ICH后炎症细胞的过度激活产生高水平的ROS，导致严重的氧化应激诱导的神经元损伤。为研究纳米酶治疗是否能保护血肿周围区域的神经元免受氧化应激，采用双重免疫荧光染色评估了具有氧化DNA损伤的神经元比例。在未经治疗的NS小鼠的血肿周围区域观察到丰富的8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）阳性神经元。相比之下，纳米酶治疗显著降低了8-OHdG阳性神经元的比例，且Ru@Mn-ZIF纳米酶比Mn-ZIF纳米酶产生了更显著的保护作用。类似地，静脉纳米酶给药也减少了氧化应激诱导的神经元损伤，尽管效果不如鼻内给药那么强。
2.8 鼻内纳米酶给药改善自体血诱导的ICH小鼠的神经功能缺损和组织病理学损伤
为在不同ICH诱导方法中
