Cer24:1：通过拮抗EP2信号约束Th17驱动的中性粒细胞炎症的内源性神经酰胺及其治疗潜能

《Advanced Science》：Endogenous Ceramide 24:1 Constrains Th17-Driven Neutrophilic Inflammation by Antagonizing EP2 Signaling

这篇研究揭示了在难治性中性粒细胞性哮喘（NA）中显著降低的极长链神经酰胺Cer24:1，是一种关键的抗炎内源性脂质介质。它通过直接靶向前列腺素E2受体EP2，抑制下游JAK2-STAT3信号通路，从而特异性抑制Th17细胞分化和中性粒细胞炎症，为治疗糖皮质激素抵抗性NA提供了新的代谢检查点和潜在治疗策略。

　　

引言：中性粒细胞性哮喘的挑战与新探索

慢性炎症失调是多种疾病发病机制的基石，其中哮喘尤为突出。在众多哮喘类型中，中性粒细胞性哮喘（Neutrophilic Asthma, NA）代表了治疗最为棘手的一种内型，其特征是Th17细胞驱动的气道炎症和糖皮质激素抵抗。与常见的由2型细胞因子（如IL-4、IL-5、IL-13）主导的嗜酸性粒细胞性哮喘不同，NA约占控制不佳病例的20%-30%。Th17细胞通过产生IL-17A、IL-17F、G-CSF等关键细胞因子，在中性粒细胞的募集和持续激活中扮演核心角色。浸润的中性粒细胞释放蛋白酶、活性氧和其他促炎介质，进一步放大组织损伤，形成一个自我传播的炎症循环，这解释了NA常见的慢性化和激素抵抗现象。

除了蛋白质类的细胞因子，脂质介质（Lipid Mediators, LMs）已被证明是炎症级联反应的关键调控者，它们不仅作为强效的促炎信号（如前列腺素、白三烯），也作为特殊的促消退介质（Specialized Pro-resolving Mediators, SPMs，如消退素、保护素、maresins），主动终止炎症并促进组织稳态。其中，鞘脂代谢失调与哮喘有关。神经酰胺是鞘脂的核心构件，其生物学效应强烈受酰基链长度影响：长链神经酰胺（Long-Chain Ceramides, LC-Cers，如C16-C20）通常与促炎信号和应激反应相关，而极长链神经酰胺（Very-Long-Chain Ceramides, VLC-Cers，通常≥C22）则更多地支持膜组织和屏障完整性。然而，具有不同酰基链长度的内源性神经酰胺种类是否在NA患者中作为抗炎/促消退介质发挥功能，以及具体是哪些种类参与其中，目前尚不清楚。

结果

1. Cer24:1缺乏与NA患者Th17细胞升高及疾病严重程度相关

为阐明NA患者的鞘脂变化，研究团队对哮喘患者和健康对照者的呼出气冷凝物（Exhaled Breath Condensate, EBC）、血浆和诱导痰样本进行了靶向脂质组学分析。结果发现，与健康对照和非NA患者相比，NA患者中多种神经酰胺水平显著降低，尤其是神经酰胺d18:1/24:1（Cer24:1）。在EBC、血浆和痰液中，这种减少是一致的。值得注意的是，血浆Cer24:1水平与循环Th17细胞比例和痰中性粒细胞比例呈负相关，但与Th1、Th2、调节性T细胞（Treg）或痰嗜酸性粒细胞无关。其他VLC-Cers（如Cer22:0和Cer26:1）也与Th17细胞和中性粒细胞呈负相关，但Cer24:1的相关性最强。此外，EBC和血浆中较低的Cer24:1水平与更高的哮喘严重程度（GINA分期5级）和更差的疾病控制（哮喘控制测试得分ACT < 20）相关，表明Cer24:1缺乏是NA疾病严重性的一个潜在生物标志物。

2. HDM/LPS诱导的NA模型小鼠再现了Th17细胞比例升高和Cer24:1水平降低

为了模拟NA患者的病理变化，研究人员建立了屋尘螨（House Dust Mite, HDM）和脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS）联合诱导的小鼠NA模型。该模型小鼠表现出气道阻力增加、支气管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar Lavage Fluid, BALF）中性粒细胞比例升高、肺组织炎症评分和粘液分泌增加，以及Th17相关细胞因子（IL-17, IL-22）水平上升。流式细胞术分析显示肺组织中Th17细胞比例增加。对BALF和肺组织的脂质组学分析同样揭示了Cer24:1和其他VLC-Cers的显著减少，这与临床发现一致。与HDM诱导的嗜酸性粒细胞哮喘模型小鼠相比，NA模型小鼠肺组织和BALF中Cer24:1水平的降低更为显著，进一步凸显了Cer24:1在NA发病机制中的相关性。

3. 补充Cer24:1可缓解中性粒细胞性哮喘

为了评估Cer24:1的治疗潜力，研究人员对HDM/LPS诱导的NA模型小鼠进行了腹腔注射Cer24:1（10 mg/kg）或溶剂对照的治疗。脂质组学证实了治疗小鼠体内Cer24:1水平升高。尽管气道阻力未变，但Cer24:1治疗显著降低了血浆IL-17A和中性粒细胞趋化因子CXCL1的水平。组织病理学评估显示，Cer24:1治疗减轻了气道炎症、粘液分泌和MPO阳性的中性粒细胞浸润。单细胞RNA测序和流式细胞术均证实，Cer24:1处理减少了肺组织中Th17细胞的比例以及BALF和肺中的中性粒细胞数量，但对Th1、Th2或Treg细胞群没有影响。有趣的是，肺中嗜酸性粒细胞数量也适度减少，提示Cer24:1可能通过非Th2介导的机制部分影响嗜酸性粒细胞募集。此外，Cer24:1治疗还抑制了细胞外基质相关通路，降低了胶原蛋白和纤连蛋白水平，表明其对气道重塑也有改善作用。重要的是，Cer24:1对HDM诱导的嗜酸性粒细胞哮喘没有治疗效果，说明其作用具有特异性，靶向Th17驱动的中性粒细胞炎症。

4. Smpd1缺失加剧了HDM/LPS诱导的NA模型小鼠的Th17主导性炎症

基因集富集分析（GSEA）显示，HDM/LPS诱导的小鼠肺组织中鞘脂生物合成通路被抑制。神经酰胺可通过从头合成和鞘磷脂水解途径合成。在NA模型肺中，这些通路中多个酶（Sptlc2, Cers2, Smpd1）的mRNA水平降低，但只有Smpd1（酸性鞘磷脂酶，VLC-Cers的主要生产者）的蛋白水平持续下降。为了确定VLC-Cer生成减少的病理影响，研究人员使用了Smpd1基因敲除（Smpd1^-/-）小鼠。这些小鼠肺和BALF中Cer24:1水平显著降低。与野生型对照相比，HDM/LPS诱导的Smpd1^-/-小鼠表现出加重的气道阻力、血浆IL-17A和IL-22水平升高、肺部炎症和中性粒细胞浸润加剧，以及肺中Th17细胞增加。重要的是，外源性Cer24:1部分挽救了Smpd1^-/-T细胞中Th17分化增加的表型。这些结果表明Smpd1缺失会加剧NA背景下的Th17驱动性炎症。

5. Cer24:1抑制Th17细胞分化

为了研究Cer24:1在T细胞分化中的直接作用，研究人员建立了体外Th17（致病性和非致病性）、Th1、Th2和诱导性Treg（iTreg）细胞分化模型。Cer24:1以剂量依赖的方式选择性抑制两种Th17亚群的分化，但不影响Th1、Th2或iTreg细胞的分化。RT-qPCR和蛋白质印迹分析证实，Cer24:1显著降低了RORγt蛋白水平以及Il-17a和Il-17f的mRNA水平，IL-17A的分泌也相应减少。重要的是，Cer24:1不影响Th17细胞的凋亡或增殖，表明其特异性作用于细胞谱系定向而非细胞活力或扩增。相比之下，其他神经酰胺种类（C16, C20, C22）不抑制Th17分化，而酸性鞘磷脂酶抑制剂阿米替林则显著促进Th17分化。

6. Cer24:1抑制Th17细胞分化的机制：靶向JAK2-STAT3通路

对Cer24:1处理的Th17细胞进行转录组分析发现，基因表达普遍下调，KEGG富集分析显示JAK-STAT信号通路是受Cer24:1干预抑制最显著的通路之一。磷酸化蛋白质组学分析证实，JAK-STAT、Th17分化和T细胞受体通路在差异磷酸化蛋白中富集。蛋白质印迹分析验证了Cer24:1降低了磷酸化STAT3（p-STAT3）和JAK2蛋白水平。给予STAT3激动剂colivelin可逆转这些效应，恢复p-STAT3水平、Th17分化和IL-17A分泌，证实Cer24:1通过抑制JAK2-STAT3轴来抑制Th17极化。

7. Cer24:1特异性结合前列腺素E₂受体EP2并抑制Th17细胞中STAT3活化

Cer24:1的亲水性鞘氨醇头部和极长疏水链限制了其通过简单亲脂扩散跨膜的能力，暗示其可能通过膜受体起作用。通过分析可用的单细胞测序数据集，研究人员聚焦于CD4⁺T细胞上表达的G蛋白偶联受体（GPCRs）。对前10个GPCR蛋白与Cer24:1进行分子对接模拟预测，发现前列腺素E2受体EP2（由PTGER2编码）与Cer24:1结合的可能性最高。分子对接和分子动力学模拟预测Cer24:1通过ARG-107、TYR-111和SER-169残基与EP2结合。功能实验表明，在测试的多种GPCR配体中，PGE₂（EP2的配体）最有效地逆转了Cer24:1介导的Th17分化抑制。表面等离子体共振（SPR）和生物素-神经酰胺下拉实验均验证了Cer24:1与EP2的直接选择性结合。蛋白质印迹分析证实，补充PGE₂可逆转Cer24:1诱导的JAK2、STAT3磷酸化及Rorγt表达的降低。虽然NA模型小鼠肺组织中EP2表达无变化，但其血浆PGE₂水平升高，且在Cer24:1治疗后进一步升高。生物素-神经酰胺下拉实验还显示，PGE₂减弱了Cer24:1与CD4⁺T细胞中EP2的相互作用，进一步支持了竞争性EP2结合。此外，Cer24:1处理降低了Th17细胞内的cAMP水平和cAMP反应元件结合蛋白（CREB）的磷酸化，而PGE₂逆转了这些变化，证实了EP2–cAMP–CREB通路参与Th17调控。

8. PGE₂在体内抵消Cer24:1对NA的缓解作用

为了探究Cer24:1与PGE₂在NA模型小鼠中的相互作用，研究人员对Cer24:1治疗的NA模型小鼠同时给予外源性PGE₂。结果显示，PGE₂逆转了Cer24:1诱导的BALF和肺组织中中性粒细胞及Th17细胞的减少。蛋白质印迹分析表明，Cer24+1可抑制肺组织p-STAT3水平，而Cer24:1与PGE₂联合治疗组与单用PGE₂组相比，p-STAT3表达也显著降低。这些结果表明，PGE₂通过促进Th17细胞扩增和STAT3活化，选择性地抵消了Cer24:1的抗炎作用。

讨论与结论

本研究表明，神经酰胺Cer24:1在中性粒细胞性哮喘中显著降低，并作为一种关键的内源性调节因子，约束致病性Th17反应。通过结合人类队列分析和小鼠模型的转化研究方法，一致观察到Cer24:1在多种样本类型中水平降低。给予Cer24:1可显著减轻小鼠的中性粒细胞炎症和哮喘关键病理特征，而Cer24:1缺乏则会加重疾病严重程度。这些发现一致表明Cer24:1是NA病理中具有保护功能的内源性调节因子。

该研究将目前对哮喘中脂质介质的理解，从经典的花生四烯酸衍生脂质和特化促消退介质，扩展到了鞘脂中心通路。Cer24:1作为一种免疫调节介质，特异性影响T细胞极化。其与EP2的相互作用提示了与已建立的脂质信号网络（特别是PGE₂-EP2/EP4轴）存在交互对话。研究提出，Cer24:1可能作为一种内源性配体，竞争性或调节性地影响前列腺素介导的反应，从而微调NA患者的炎症微环境。这一通路代表了一个有前景的治疗干预靶点，特别是对于常规疗法无效的激素抵抗性内型患者。

在机制上，Cer24:1通过直接结合EP2，竞争性拮抗PGE₂信号，抑制下游的JAK2-STAT3–RORγt信号轴，从而特异性抑制Th17细胞分化，并减轻Th17驱动的中性粒细胞气道炎症和重塑。研究强调了神经酰胺酰基链长度依赖性功能的差异：多数VLC-Cers（尤其是Cer24:1）与Th17细胞比例和痰中性粒细胞计数呈负相关，而多数LC-Cers则无显著关联。

综上所述，Cer24:1水平在NA患者中降低，且与Th17细胞比例和中性粒细胞计数呈负相关。在机制上，Cer24:1结合EP2并抑制EP2–JAK2–STAT3–RORγt信号通路，从而抑制Th17分化，改善气道炎症和重塑。这些结果凸显了Cer24:1作为一种特化的促消退介质，是治疗中性粒细胞性哮喘的潜在代谢治疗剂。