《Advanced Science》：The ITGB2-COPS3-SOX2 Axis and SOX2 Liquid-Liquid Phase Separation: Dual Mechanisms Governing Osteosarcoma Stemness
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本研究揭示了调控骨肉瘤干细胞（CSC）特性、驱动化疗耐药和肺转移的双重分子机制。文章系统阐述了从细胞外基质受体ITGB2、经17p11.2关键基因COPS3、到核心转录因子SOX2的信号传递轴。首次在骨肉瘤中证实SOX2通过液-液相分离（LLPS）形成生物分子凝聚体，对维持肿瘤干性至关重要。基于此机制，研究筛选出高选择性COPS3抑制剂Z-5891，在体内外有效抑制肿瘤生长并逆转干细胞特性，为克服骨肉瘤耐药和转移提供了全新理论框架和候选药物。
引言
骨肉瘤是一种源于间叶组织的高度恶性骨肿瘤，好发于儿童和青少年。尽管新辅助化疗和手术技术的进步将患者五年生存率提升至50%–60%，但在过去40年中，生存率未能取得进一步显著提高。化疗耐药和肺转移，尤其是后者，仍是导致患者死亡的主要原因。大量证据表明，癌症干细胞（CSC）是驱动骨肉瘤化疗耐药、复发和转移的核心细胞亚群。这些细胞具有自我更新和多向分化潜能，通过对称或不对称分裂维持肿瘤异质性，并介导治疗抵抗。因此，靶向CSC被视为改善骨肉瘤预后的潜在策略。
近年来，液-液相分离（LLPS）作为一种重要的生物大分子组织机制备受关注。它通过促进无膜细胞器的形成，参与调控基因转录、染色质动力学和信号转导等关键生物学过程，并在多种恶性肿瘤的发生发展中扮演关键角色。值得注意的是，LLPS在维持CSC干性中的作用逐渐被揭示。同时，骨肉瘤基因组具有高度复杂性，其特征之一是频繁的拷贝数扩增和结构变异。其中，染色体17p11.2区域是骨肉瘤中最常发生扩增的区域之一，而位于该区域的COPS3基因扩增与骨肉瘤的基因组不稳定性和肺转移密切相关。本团队前期研究发现COPS3不仅促进肺转移，还显著增强化疗耐药性，而这两种表型正是CSC最具代表性的恶性特征。基于此，本研究旨在系统阐明COPS3在维持骨肉瘤细胞干性中的功能及其分子机制，并探索靶向干预的新策略。
结果
1. COPS3高表达维持骨肉瘤细胞干性
研究首先利用公共单细胞RNA测序数据集，通过整合分析鉴定骨肉瘤微环境中的细胞亚群。在通过拷贝数变异（CNV）计算鉴定出肿瘤细胞后，根据COPS3表达水平将其分为COPS3+和COPS3-两组。差异表达、KEGG和GSEA富集分析显示，COPS3+细胞中过表达的基因主要富集于细胞周期、DNA复制等过程。进一步的GSVA和irGSEA分析表明，WNT、MYC等CSC相关通路在COPS3+细胞中被显著激活。干细胞特性评估显示，COPS3+细胞簇具有更高的干性评分和分化潜能。
在细胞功能层面，Western blot、流式细胞术和免疫荧光染色证实，敲低COPS3可显著降低多种CSC标志物（如CD133、NANOG、SOX2）的表达及CD133+细胞比例，而过表达COPS3则产生相反效果。同时，COPS3敲低显著降低了细胞的乙醛脱氢酶（ALDH）活性、失巢凋亡抵抗能力和对阿霉素（DOX）的化疗抵抗，并损害了细胞的成球能力；而过表达COPS3则增强了这些表型。极限稀释分析定量显示，敲低COPS3显著降低了143B细胞中成球起始细胞的频率，而过表达COPS3则显著提高了Saos-2细胞的自我更新能力。最后，对42例原发性骨肉瘤和28例肺转移性骨肉瘤组织的免疫组化分析显示，COPS3的表达与多种CSC标志物的表达呈显著正相关，在临床样本中验证了上述结论。
2. COPS3通过稳定SOX2并抑制其泛素化降解来维持骨肉瘤干性
为探究其分子机制，研究预测并验证了COPS3与转录因子SOX2之间存在特异性结合。分子对接显示两者结合能低，结合界面存在多个氢键和疏水相互作用。免疫共沉淀（Co-IP）证实了它们的相互作用，免疫荧光显示两者在细胞核内共定位。机制上，敲低COPS3导致SOX2蛋白水平显著降低，但mRNA水平不变，提示COPS3影响SOX2的稳定性。环己酰亚胺（CHX）追踪实验表明，敲低COPS3显著缩短了SOX2的半衰期。蛋白酶体抑制剂MG132处理可逆转COPS3敲低引起的SOX2降解。进一步研究发现，敲低COPS3的细胞中SOX2的泛素化水平显著升高，表明COPS3通过抑制泛素-蛋白酶体途径介导的蛋白降解来维持SOX2的稳定性。
功能回复实验证实，SOX2是COPS3调控干性的关键下游效应分子。在过表达COPS3的Saos-2细胞中敲低SOX2，可以逆转由COPS3过表达引起的CSC标志物表达上调、ALDH活性增强、失巢凋亡抵抗、阿霉素抵抗及成球能力增强等表型。染色质免疫沉淀（ChIP）-PCR实验进一步证实，SOX2可直接结合COPS3、NANOG和CD133的启动子区域，从而激活其转录，形成了一个强化干细胞表型的正反馈环路。
3. SOX2通过液-液相分离驱动骨肉瘤干细胞特性
值得注意的是，SOX2蛋白含有固有无序区域，提示其可能发生LLPS。研究发现，纯化的SOX2在体外可形成浓度依赖性的液滴，表现出经典的相分离行为，且可被1,6-己二醇抑制。细胞内荧光漂白恢复（FRAP）实验显示，SOX2凝聚体具有动态流动性，符合LLPS的特征。为探究SOX2相分离在其功能中的作用，用1,6-己二醇处理细胞抑制LLPS。结果发现，虽然SOX2蛋白水平基本不变，但其下游干性相关基因的蛋白表达却显著降低，表明抑制LLPS破坏了SOX2的转录激活功能。同样，抑制LLPS也显著减弱了细胞的ALDH活性、失巢凋亡抵抗和成球能力，证明SOX2介导的LLPS对于维持CSC特性至关重要。
4. ITGB2通过影响COPS3调控骨肉瘤细胞干性
尽管COPS3通过SOX2调控癌症干性的机制已初步建立，但其上游调控信号仍不清楚。前期实验观察到敲低COPS3会显著削弱细胞对细胞外基质（ECM）的粘附能力。整合素是介导细胞-基质相互作用的关键受体。研究预测并验证了细胞外基质受体ITGB2与COPS3之间存在特异性相互作用。分子对接显示两者结合能低，结合界面存在氢键。Co-IP和免疫荧光共定位实验证实了两者的相互作用。
有趣的是，激活ITGB2信号后，可观察到COPS3在细胞核内的积累显著增加，提示ITGB2可能通过促进COPS3的核转位来调控其功能。对敲低ITGB2的143B细胞进行RNA测序，结果显示ITGB2缺失显著改变了多个干性相关基因的表达，GO和KEGG富集分析表明多个与维持癌症干性相关的通路受到影响。
基于这些发现，研究假设ITGB2通过COPS3调控骨肉瘤干性。在稳定过表达ITGB2的Saos-2细胞中敲低COPS3，结果显示ITGB2过表达显著增强了干性相关标志物的表达，而敲低COPS3有效逆转了此效应。在ALDH活性、失巢凋亡抵抗、阿霉素抵抗和成球能力等功能实验中，敲低COPS3同样显著削弱了由ITGB2过表达增强的干细胞表型。最后，对临床样本的免疫组化分析显示，ITGB2的表达与多种CSC标志物呈显著正相关，而免疫荧光分析则显示患者组织中存在ITGB2与COPS3、以及COPS3与SOX2的显著共定位，为ITGB2-COPS3-SOX2信号轴在骨肉瘤中的存在和临床相关性提供了关键证据。
5. 综合虚拟筛选与分子动力学模拟鉴定出靶向COPS3的先导化合物Z-5891
基于上述机制，研究致力于开发靶向COPS3蛋白功能的小分子抑制剂。首先对COPS3蛋白进行结构预处理并预测其结合口袋，选择高置信度的位点进行虚拟筛选。对Enamine Hit Locator库（约46万个小分子）进行预处理后用于分子对接，经过打分、去重、蛋白-配体相互作用指纹（PLIF）分析、结合自由能筛选、结构多样性聚类以及类药性和PAINS特性评估，最终筛选出52个小分子进行实验验证。
通过CellTiter-Glo（CTG）增殖抑制实验和表面等离子体共振（SPR）结合亲和力评估，鉴定出一个先导小分子Z-5891，其对143B细胞抑制率超过90%，并与COPS3蛋白具有高结合亲和力。分子对接和分子动力学模拟显示，Z-5891与COPS3形成广泛的相互作用，包括与关键氨基酸残基的氢键、疏水作用和π-π堆积，复合物体系平衡后结合稳定，计算得到的平均MM/GBSA结合自由能为-60.25 kcal/mol，表明两者结合强而稳定。
6. 靶向COPS3的Z-5891抑制骨肉瘤恶性表型和干性
研究系统评估了Z-5891在细胞水平抑制肿瘤增殖和癌症干性的能力。Z-5891在三种内源性COPS3表达水平不同的骨肉瘤细胞系中表现出差异性的IC50，其中高表达COPS3的143B细胞最敏感，进一步支持COPS3是该化合物的功能靶点。Transwell实验表明Z-5891处理显著抑制了细胞迁移和侵袭能力。同时，骨肉瘤细胞对ECM的粘附能力也显著降低。免疫荧光显示，Z-5891处理后上皮标志物E-钙粘蛋白表达上调，间质标志物N-钙粘蛋白下调，表明上皮-间质转化（EMT）过程被有效抑制。流式细胞术凋亡分析显示Z-5891处理显著增加了细胞凋亡率。
在癌症干性方面，Z-5891处理显著降低了关键CSC标志物的表达。一致地，Z-5891处理也显著削弱了细胞的ALDH活性、失巢凋亡抵抗、阿霉素抵抗和成球能力。这些发现证明靶向COPS3能有效抑制骨肉瘤细胞的癌症干细胞特性。
7. COPS3抑制剂Z-5891与阿霉素协同抑制骨肉瘤生长并逆转癌症干性
在体内，通过建立骨肉瘤小鼠皮下移植瘤模型，评估Z-5891的体内抗肿瘤疗效。与溶剂组相比，Z-5891单药和阿霉素（DOX）单药均能显著抑制肿瘤生长。值得注意的是，Z-5891与DOX联合治疗组显示出最强的抗肿瘤效果，肿瘤体积和质量均显著低于任一单药组，表明两者存在协同作用。为明确评估COPS3对骨肉瘤干细胞体内成瘤能力的影响，进行了极限稀释成瘤实验。分析显示，抑制COPS3（无论是基因敲低还是Z-5891药理学抑制）都显著降低了肿瘤起始细胞的频率。
对肿瘤组织的免疫组化分析进一步揭示了其潜在机制。天狼星红染色和马松三色染色显示，各治疗组胶原纤维沉积均减少，表明肿瘤基质重塑受到抑制。Ki67染色显示各治疗组增殖指数显著降低。TUNEL实验显示各治疗组细胞凋亡率均显著高于溶剂组，联合治疗组凋亡细胞最多。特别重要的是，对各组癌症干性的评估显示，Z-5891单药治疗显著降低了经典CSC标志物的表达。与此形成鲜明对比的是，DOX单药治疗不仅未能降低，反而在一定程度上增加了CSC相关标志物的表达。然而，当Z-5891与DOX联用时，完全逆转了DOX诱导的这一现象，并同样实现了癌症干性的显著降低。
组织学分析和血清生化检测表明，在有效剂量下，Z-5891未引起可检测到的器官损伤或肝功能异常，显示出良好的安全性。
讨论与总结
本研究系统阐明了COPS3在调控骨肉瘤干细胞特性中的核心作用，并揭示了一个从ITGB2-COPS3-SOX2信号轴到SOX2 LLPS的、层级式的干细胞特性调控级联。通过多组学分析和功能实验，证实COPS3通过增强骨肉瘤细胞的自我更新能力、化疗抵抗和失巢凋亡抵抗来促进其干性。重要的是，研究发现并验证了ITGB2与COPS3的特异性相互作用，证明ITGB2激活可促进COPS3核转位。进入核内的COPS3通过抑制SOX2的泛素化降解来维持其蛋白稳定性并增强其转录活性，从而形成正反馈环路，强化干细胞表型。此外，研究首次在骨肉瘤中发现SOX2可通过LLPS形成生物分子凝聚体，并证明了SOX2介导的LLPS在维持骨肉瘤干细胞特性中的关键作用。这些发现为理解骨肉瘤干细胞特性的分子调控提供了新见解。
基于此，研究通过基于结构的药物设计，鉴定出靶向COPS3的小分子抑制剂Z-5891。体内外实验表明，Z-5891具有显著的抗肿瘤功效，能有效抑制骨肉瘤生长并降低癌症干细胞特性，且与阿霉素联用显示出协同作用，并能逆转阿霉素可能诱导的干细胞特性富集现象，同时表现出良好的生物安全性。
综上所述，本研究不仅揭示了从微环境信号到核内相分离的完整骨肉瘤干细胞特性调控通路，为克服骨肉瘤的耐药和转移提供了全新的理论框架，还鉴定出具有转化潜力的治疗靶点COPS3及其先导化合物Z-5891，为骨肉瘤的靶向治疗带来了新的希望。
