《Advanced Science》：Tumor-Derived Exosomal TAGLN2 Promotes Metastasis by Inducing Vascular Permeability and Angiogenesis via the NRP1/SEMA4D/YAP Axis
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本文推荐一篇在胃癌（GC）血管重塑机制研究中的重要文献。该研究揭示了肿瘤细胞通过分泌外泌体（TEXs），将关键蛋白TAGLN2传递至内皮细胞（ECs），进而激活全新的NRP1/SEMA4D/YAP信号轴，诱导血管生成（Angiogenesis）、内皮-间质转化（EndoMT）和内皮连接破坏，最终驱动肿瘤血管功能障碍和转移。研究不仅阐明了该轴的分子机制，还证实循环外泌体TAGLN2是潜在的诊断标志物，且靶向该轴能有效抑制肿瘤进展并与化疗/抗血管药物协同增效，为转移性胃癌的诊断和治疗提供了整合性靶点。
引言
胃癌（GC）是全球高发恶性肿瘤，其致死主要归因于远处转移。研究证实，原发性肿瘤在转移灶定植前，即可通过分泌肿瘤源性细胞外囊泡（EVs），特别是外泌体（TEXs, 30–150 nm），系统性地预处理远处微环境，形成转移前龛。TEXs通过递送多种生物活性物质，在免疫抑制、基质活化、代谢适应等促转移过程中扮演关键角色。其中，TEXs对血管内皮的重编程（即血管去稳定化）日益受到关注，主要表现为诱导血管生成和增加血管通透性，这两个过程是促进肿瘤转移扩散的关键环节。然而，其在胃癌中的具体分子机制尚不明确。
本研究聚焦于Transgelin-2（TAGLN2），这是一种细胞骨架调节蛋白，在多种恶性肿瘤中过表达，并通过整合肌动蛋白动力学与信号通路在肿瘤进展中发挥重要作用。有趣的是，TAGLN2在包括尿液和结肠肿瘤细胞系来源的外泌体的蛋白质组学研究中已被鉴定，但其作为外泌体货物的生物学功能完全未知。
本研究旨在探究外泌体TAGLN2如何作为胃癌细胞与内皮细胞（ECs）之间的关键纽带，驱动血管去稳定化从而加速转移。我们证实了胃癌来源的外泌体能将功能性的TAGLN2高效递送至内皮细胞，从而协调血管生成、内皮-间质转化和内皮完整性的破坏。在机制上，我们确定了NRP1/SEMA4D/YAP信号轴是外泌体TAGLN2重编程内皮细胞的核心。我们将这些机制发现与临床相关性联系起来，评估了胃癌患者血清中外泌体TAGLN2的水平，并评估了靶向该轴的潜在治疗价值，包括其与顺铂化疗和抗血管内皮生长因子（VEGF）药物贝伐珠单抗的协同作用。
结果
TAGLN2在胃癌细胞和肿瘤内皮细胞中协同上调
对90例胃癌患者肿瘤组织和配对正常组织的多重免疫荧光分析显示，肿瘤组织中TAGLN2和内皮细胞标志物CD34的表达均显著升高。在肿瘤相关内皮细胞（TAGLN2+CD34+）中，TAGLN2表达显著高于匹配的正常组织。肿瘤细胞来源的TAGLN2与内皮CD34表达、内皮TAGLN2表达均呈强正相关，且这种相关性特异性存在于细胞角蛋白（CK）阳性的肿瘤区域。此外，内皮细胞内的TAGLN2和CD34表达在所有组织中呈正相关，且在肿瘤组织内，尤其是在CK+区域相关性最强。高内皮TAGLN2强度与胃癌患者存在淋巴浸润、晚期N分期和总生存期降低显著相关。
TAGLN2诱导内皮高通透性和血管生成
对过表达TAGLN2与对照的原代人脐静脉内皮细胞（HUVECs）进行RNA测序（RNA-seq），鉴定了86个差异表达基因。前10个富集的基因本体（GO）术语主要包括阿米巴样细胞迁移、细胞连接组装、发育生长参与的形态发生、凋亡信号、细胞生长和微管组织。其中关键基因包括NRP1、SEMA4D、ZEB2、MACF1、PTPRS、MEF2C和YAP。体内Matrigel plug实验显示，含有过表达TAGLN2内皮细胞的胶塞，其新生血管密度显著增加。Tagln2基因敲除（Tagln2?/?）小鼠的胃组织免疫染色显示，新生血管标志物CD34表达显著降低，而成熟血管标志物CD31表达无显著变化。同时，Tagln2?/?小鼠胃组织内皮层中连接蛋白Occludin和VE-cadherin表达显著升高，间质标志物N-cadherin表达降低。功能上，在EA.hy926或HMEC-1内皮单层中过表达TAGLN2，显著增加了对罗丹明-葡聚糖（Rhodamine-dextran）的通透性。与此屏障破坏一致，我们观察到标记的肿瘤细胞（CM-DiI标记的HGC-27、HGC-27/GFP或SGC-7901/GFP）穿过过表达TAGLN2的内皮单层的跨内皮侵袭增强。
NRP1/SEMA4D轴介导TAGLN2驱动的血管功能障碍
鉴于NRP1作为血管内皮生长因子（VEGF）在血管生成中的共受体作用，其表达显著上调，我们推测NRP1过表达是TAGLN2的关键下游事件。对过表达NRP1的HUVECs进行RNA-seq，鉴定了94个差异表达基因。功能富集揭示了血管生物学的关键通路，包括轴突发生、内皮细胞分化、氧化应激反应、发育性细胞生长、信号素-丛状蛋白信号通路和血管内皮生长因子受体信号通路。最引人注目的发现是，TAGLN2和NRP1的过表达均能诱导SEMA4D表达增加超过10倍（log2FC）。这些发现共同定义了一个连贯的TAGLN2-NRP1-SEMA4D转录轴。
过表达TAGLN2或SEMA4D可诱导内皮细胞发生梭形形态转变，并显著增强细胞迁移和毛细血管样管腔形成，而敲低任一基因则可逆转这些表型和功能改变。重要的是，TAGLN2驱动的形态和促血管生成效应在NRP1敲低后基本被消除。在分子水平上，TAGLN2过表达增加了NRP1、SEMA4D、血管生成标志物（VEGFR2和vWF）的蛋白水平，并激活了MAPK/ERK通路，同时降低了凋亡标志物（cleaved PARP1和Caspase 3）的水平。在相同的实验条件下，TAGLN2/NRP1/SEMA4D轴协调了一个全面的内皮-间质转化程序，驱动了内皮标志物（E-cadherin和Tie1/2）的下调和间质标志物（N-cadherin、α-SMA、FSP-1、Vimentin）的上调，以及核心的上皮-间质转化转录因子（Snail、Slug、Twist、ZEB1）的上调。同时，该轴通过下调关键的粘附连接（VE-cadherin）和紧密连接蛋白（Occludin、ZO-1、Claudin 1、Claudin 5）破坏了内皮屏障完整性。免疫荧光分析证实了轴激活后，VE-cadherin和Occludin从细胞连接处消失。作为肌动蛋白结合蛋白，TAGLN2在F-肌动蛋白稳定中起着关键作用。该轴的激活显著增加了肌动蛋白丝密度，增强了F-肌动蛋白聚合，并促进了粗的肌动蛋白应力纤维形成。这些发现共同确立，NRP1/SEMA4D轴是TAGLN2重编程内皮细胞、协调促血管生成、促迁移、间质转化、屏障破坏和细胞骨架变化的核心机制。
TAGLN2上调NRP1表达并通过NRP1/SEMA4D轴激活YAP
染色质免疫沉淀（ChIP）和qPCR分析显示，与阴性对照相比，TAGLN2在NRP1启动子区域（-225至-1 bp）有显著富集。荧光素酶报告基因实验证实，c-Jun（AP-1的主要成分）或SP1与NRP1启动子报告基因共转染可显著增强荧光素酶活性，在过表达TAGLN2的内皮细胞中效果更明显。功能获得或缺失实验证实，TAGLN2、c-Jun和SP1正向调节NRP1启动子活性。重要的是，敲低TAGLN2减弱了c-Jun或SP1的增强效应，而敲低c-Jun或SP1则消除了TAGLN2诱导的NRP1启动子激活。此外，敲低c-Jun或SP1降低了NRP1和SEMA4D的蛋白水平，但不影响TAGLN2水平。免疫共沉淀（Co-IP）证实了内源性TAGLN2与c-Jun和SP1之间的直接物理相互作用。这些结果共同表明，TAGLN2通过促进c-Jun和SP1募集到其启动子区域，从而转录上调NRP1表达。
由于RNA-seq鉴定出YAP是TAGLN2过表达后显著上调的基因，并且YAP在血管生成和内皮连接稳定性中发挥多方面的作用，我们通过Hippo通路核心激酶级联检查了其调控。TAGLN2或SEMA4D的过表达显著降低了MST1/2、p-MST1(Thr183)/MST2(Thr180)、LATS1、p-LATS1(Thr1079)和p-YAP(Ser127)的蛋白水平。同时，Ajuba（抑制LATS1/2的YAP正调节因子）、PTPN14、YAP、TAZ和β-连环蛋白（从破坏复合体中释放）的水平显著增加，而上游调节因子NF2保持不变。敲低TAGLN2或SEMA4D可逆转这些效应，而敲低NRP1则可消除TAGLN2介导的Hippo信号抑制。
使用靶向LATS1/2的Hippo通路抑制剂GA-017处理，降低了敲低了TAGLN2、NRP1、SEMA4D的EA.hy926细胞中MST1/2、p-MST1/MST2、LATS1、p-LATS1和p-YAP的水平，并增加了TAZ和β-连环蛋白的水平。此外，GA-017显著逆转了敲低TAGLN2、NRP1或SEMA4D诱导的连接蛋白（Occludin、ZO-1和VE-cadherin）上调，证实Hippo通路失活是轴介导的屏障破坏的核心。
为了功能性评估YAP/TEAD的转录输出，我们使用了含有8个合成TEAD结合位点的8× GTIIC-Luc报告基因构建体。TAGLN2过表达使TEAD依赖性转录活性增强了6倍以上，此效应可被NRP1敲低消除，但可被补充SEMA4D恢复。在使用TOPFlash/FOPFlash报告系统的β-连环蛋白/TCF依赖性转录中也观察到类似模式。最后，SP1或c-Jun的过表达显著增强了8× GTIIC-Luc报告基因活性，而敲低TAGLN2或NRP1几乎完全消除了这种活性。在TOPFlash/FOPFlash报告基因检测中也观察到了一致的模式。这些结果确立了YAP是TAGLN2/NRP1/SEMA4D轴的关键下游效应子，对于介导其对内皮细胞的调节作用至关重要。
胞质TAGLN2/NRP1/SEMA4D三元复合体通过不依赖PlexinB1-RhoA/ROCK的机制激活YAP
免疫共沉淀证实了TAGLN2和NRP1之间的内源性相互作用。GST pull-down实验进一步显示，GST-TAGLN2与His-NRP1的结合依赖于SEMA4D的存在。此外，增加重组TAGLN2的量（100–200 μg）可将GST-SEMA4D与NRP1的相互作用增强2.3–4.6倍，表明TAGLN2促进三元复合体的形成。放线菌酮（CHX）追踪实验显示，敲低TAGLN2加速了NRP1和SEMA4D的降解，将其半衰期分别从约7.7小时缩短至4.8小时和从6.0小时缩短至4.6小时，而SP1的稳定性不受影响。
亚细胞分级分离显示，TAGLN2过表达增加了NRP1和SEMA4D在胞质中的积累，但显著降低了YAP的胞质/核比率（从8.5降至2.5），表明YAP核转位增强。鉴于NRP1可以结合并将YAP滞留在胞质中，我们研究了三元复合体对这种相互作用的影响。免疫共沉淀实验显示，SEMA4D过表达显著减少了NRP1与YAP之间的结合，同时增强了NRP1、TAGLN2和SEMA4D之间的相互作用。使用抗YAP抗体的反向免疫共沉淀证实，SEMA4D显著削弱了NRP1-YAP的关联。这些结果表明，SEMA4D在胞质中竞争性地与NRP1结合，从而将YAP从NRP1-YAP复合体中置换出来。
在选择性透化条件下的免疫荧光显示，过表达TAGLN2或SEMA4D可将NRP1从膜上重新分布到胞质中。相反，敲低它们会减少胞质NRP1而不影响其膜定位。SEMA4D通常在胞质/膜和核中分布，当NRP1水平升高时，其完全转位至胞质并与NRP1共定位，同时伴随YAP上调和核积聚。相反，当NRP1水平低时，SEMA4D定位于核，YAP表达和核转位被抑制。
SEMA4D是一种膜锚定蛋白，可被切割释放可溶性片段（~120 kDa，sSEMA4D），其经典信号是通过其受体PlexinB1破坏内皮连接。为了确定TAGLN2/NRP1/SEMA4D轴是否通过这种经典的旁分泌机制起作用，我们首先检测了sSEMA4D的分泌。酶联免疫吸附测定（ELISA）分析显示，只有当SEMA4D在胃癌或内皮细胞中单独过表达时，sSEMA4D水平才显著增加。相比之下，单独或联合调节TAGLN2、NRP1、SP1或c-Jun均未诱导可检测的sSEMA4D释放。这表明该轴不依赖于生成可溶性配体来发挥功能。
我们接下来直接探究了对经典受体PlexinB1的需求。在毛细血管样管腔形成实验中，由TAGLN2或NRP1过表达驱动的强效促血管生成效应在PlexinB1敲低后基本保留，与受体充足细胞中的效应相比无统计学意义的减弱。相反，单独过表达SEMA4D所增强的管腔形成在PlexinB1敲低后被完全消除；这种组合反而显著抑制了管腔生成，将网络形成降低到远低于对照的水平。
与功能数据一致，分子谱分析证实了这种二分法。由该轴驱动的关键信号事件，包括YAP激活（p-YAP减少，YAP、TAZ、β-连环蛋白增加）、ROCK活性抑制（p-MYPT1/p-MLC减少）和内皮连接解体（Occludin、VE-cadherin、ZO-1下调），在PlexinB1缺陷细胞中过表达TAGLN2后仍强烈持续，并在单独过表达NRP1的细胞中基本维持（尽管适度减弱）。相反，单独过表达SEMA4D诱导的所有效应在PlexinB1敲低后完全逆转，p-MYPT1/p-MLC、p-YAP和连接蛋白水平显著上升至基线以上，从遗传学上证明了三元复合体参与了一条不依赖于经典SEMA4D受体的信号通路。
为了进一步剖析与经典下游通路的关系，我们使用了ROCK特异性抑制剂Y-27632。正如预期，抑制ROCK抑制了其自身活性（减少p-MYPT1/p-MLC2）。值得注意的是，即使在没有抑制剂的情况下，激活TAGLN2/NRP1/SEMA4D轴也强烈抑制了ROCK活性。Y-27632与轴激活的组合进一步抑制了ROCK活性并破坏了细胞连接（例如ZO-1丢失），同时协同放大了YAP激活。这表明该轴不需要ROCK活性来激活YAP；相反，它与ROCK抑制平行作用，两种干预措施汇聚以最大程度地解除对YAP的抑制。从三个独立角度收集的这些数据共同证实，胞质TAGLN2/NRP1/SEMA4D复合体通过一种绕过经典受体PlexinB1及其经典效应子RhoA/ROCK的机制激活YAP。
外泌体TAGLN2通过NRP1/SEMA4D/YAP轴促进血管生成和内皮功能障碍
功能获得和缺失分析证实了TAGLN2在胃癌细胞系中的致癌作用，促进增殖、迁移、侵袭、克隆形成和细胞周期进展，同时抑制凋亡。基因本体分析提示TAGLN2与细胞外囊泡/外泌体相关。CK阳性肿瘤区域内肿瘤细胞来源的与内皮TAGLN2表达的强相关性，支持了TAGLN2通过外泌体进行细胞间转移的假说。
从过表达TAGLN2、敲低TAGLN2的BGC-823细胞及其各自对照中分离出外泌体。它们呈现出典型的杯状形态，平均尺寸约为78 nm。蛋白质印迹证实了外泌体标志物（TSG101、CD9、CD81）的存在，Calnexin的缺失，以及TAGLN2在过表达外泌体中的富集。共聚焦显微镜证实了PKH26标记的外泌体被内皮细胞高效摄取。为了明确证实外泌体包裹的TAGLN2是活性介质，我们使用来自稳定表达3×Flag-TAGLN2或EGFP（对照）的BGC-823细胞的外泌体进行了免疫共沉淀。将这些外泌体与内皮细胞共培养18小时后，使用抗Flag抗体对细胞裂解液进行免疫沉淀。值得注意的是，外泌体Flag-TAGLN2（而非对照）特异性下拉了受体细胞内源性的NRP1、SEMA4D、SP1和c-Jun，这为外泌体TAGLN2在靶细胞中与其信号轴核心组分的物理相互作用提供了直接生化证据。
用外泌体处理内皮细胞显示，对照外泌体和TAGLN2过表达外泌体增强了细胞迁移、管腔形成以及促血管生成因子（TAGLN2、NRP1、SEMA4D、VEGFR2、CD31和vWF）的表达，其中TAGLN2过表达外泌体效果最强。相反，敲低TAGLN2的外泌体抑制了这些过程。在机制上，对照外泌体或TAGLN2过表达外泌体处理显著下调了关键连接蛋白（Occludin、ZO-1、Claudin 5、VE-cadherin、E-cadherin），并上调了N-cadherin，其效应与外泌体TAGLN2含量相关，并破坏了Occludin在细胞连接处的定位。此外，外泌体TAGLN2抑制了Hippo信号，降低了MST1/2、p-MST1/MST2、LATS1、p-LATS1和p-YAP的水平，同时增加了Ajuba、PTPN14、YAP、TAZ和β-连环蛋白的水平。敲低TAGLN2的外泌体则产生相反效应。使用其他胃癌细胞系（MGC-803、SGC-7901）的外泌体也观察到一致结果，它们同样上调了TAGLN2、NRP1、SEMA4D，激活了YAP，并破坏了内皮连接。
我们接下来评估了外泌体TAGLN2是否同样不依赖PlexinB1发出信号。正如预期，对照外泌体和TAGLN2过表达外泌体均促进了YAP激活和连接解体，其中TAGLN2过表达外泌体在对照细胞中诱导的幅度显著更大。关键的是，与图中的遗传学数据直接平行，即使在PlexinB1缺陷细胞中，与PBS或对照外泌体处理相比，TAGLN2过表达外泌体强烈抑制p-MYPT1/p-MLC和p-YAP，同时激活YAP/β-连环蛋白并抑制Occludin/ZO-1的效应仍强烈持续。这些结果直接证明，外泌体递送的TAGLN2参与了所鉴定的三元复合体轴，且不依赖于经典的SEMA4D-PlexinB1通路。
外泌体TAGLN2在体内促进肿瘤血管功能障碍、进展和转移
为了研究外泌体TAGLN2的体内功能，对携带皮下BGC-823异种移植瘤的小鼠进行瘤内注射对照外泌体或TAGLN2过表达外泌体。光声成像显示，TAGLN2过表达外泌体组的平均肿瘤氧饱和度和总血红蛋白含量均显著降低，表明血管灌注受损和缺氧加剧。一致地，TRITC-葡聚糖外渗实验显示，TAGLN2过表达外泌体处理的肿瘤中内皮屏障严重破坏，表现为广泛的荧光葡聚糖聚集和显著更大的葡聚糖阳性区域。
同时，给予外泌体显著促进了肿瘤生长，反映在肿瘤进展曲线和最终
