一种立体定向注射方法，用于建立具有临床意义的胚基出血小鼠模型

《Journal of Neuroscience Methods》：A stereotactic injection method to establish a clinically relevant germinal matrix hemorrhage murine model

Gio Jison等人建立了新生鼠小脑Eminence靶向注射模型，优化了胶原蛋白酶剂量（0.024 CDU/μL），成功诱导剂量依赖性室管膜积水，并通过GFAP和CD68标记验证注射准确性，为研究GMH相关炎症机制提供新工具。

　　

吉奥·吉森（Gio Jison）|诺亚·拉莫斯（Noah Ramos）|塞琳·陶-昆·陈（Celine Thao-Quyen Tran）|悉尼·米洛（Sydney Milo）|阿米尔霍赛因·沙赫里亚里（Amirhossein Shahriari）|佐拉·萨托（Sora Sato）|迈克尔·勒（Michael Le）|斯宾塞·萨巴哈特（Spencer Sabahat）|伊芙琳·托雷斯（Evelyn Torres）|亚历杭德拉·帕迪利亚（Alejandra Padilla）|成贤（Seunghyun Lee）|亚历山德拉·拉蒂尼（Alexandra Latini）|莱安德罗·卡斯塔涅拉-鲁伊斯（Leandro Casta?eyra-Ruiz）|迈克尔·穆霍宁（Michael Muhonen）|布莱恩·W·哈纳克（Brian W. Hanak）

CHOC儿童研究所，CHOC儿童医院，加利福尼亚州奥兰治市，92868，美国

摘要

背景

通过将梭菌胶原酶注射到神经节隆起（ganglionic eminence，简称GE，即胚基基质）中，已经建立了一种能够模拟胚基基质损伤和脑室内出血的模型。

新方法

采用基于体重的胶原酶剂量进行了剂量-反应注射研究，这些剂量是根据已建立的大鼠模型推算得出的。通过以下立体定向注射方案实现了对新生小鼠右侧GE的可重复靶向：针头进入位置位于lambda点外侧1.1毫米、前方1.5毫米处，并在注射胶原酶前插入到1.3毫米的深度。

结果

与对照组相比，所有胶原酶注射组都观察到了高比例的脑室扩大现象，且这种效应具有显著的剂量依赖性。研究发现，基于体重的胶原酶等效剂量（0.024胶原酶消化单位[CDU] /μL）是适用于该新生小鼠模型的最佳剂量。GFAP和CD68的阳性标记表明注射位置准确。

与现有方法的比较

目前尚未建立一种能够利用立体定向注射方法和基于体重的剂量推算来模拟胚基基质损伤的新生小鼠模型，同时实现高比例脑积水且并发症和死亡率较低的方法。

结论

我们开发了一种具有可重复立体定向注射坐标的胚基基质出血/出血后脑积水（GMH/PHH）小鼠模型。该模型为未来使用基因修饰小鼠品系的研究奠定了基础，有助于深入理解获得性脑积水的炎症相关分子机制，并支持潜在治疗干预措施的临床前评估。

引言

胚基基质出血（GMH）发生在大约20%的胎龄小于32周的早产婴儿中，每年在美国约有12,000名婴儿受到影响。由于其20-30%的死亡率，它是早产婴儿发病和死亡的主要原因。（Ballabh, 2014; Kochanek et al., 2012; Osterman et al., 2015）出血后脑积水（PHH）是GMH患者的主要并发症，约60%的GMH病例会出现这种情况。胚基基质是神经元和胶质细胞分化的胚胎脑区，该区域血管丰富，含有脆弱的薄壁血管，因此极易发生出血。如果出血严重，室管膜可能会破裂，导致脑室内出血（IVH），从而增加发生PHH的风险。（Ballabh, 2014; Robinson, 2012）发生GMH/IVH并发展为PHH的早产婴儿通常需要多种侵入性干预措施来控制脑积水，这些措施可能包括多次腰椎穿刺、放置脑室引流装置以反复抽取脑脊液（CSF），或临时放置脑室-硬脑膜分流管。最终，大多数婴儿需要永久性脑脊液分流管的植入，通常是脑室-腹腔或脑室-心房分流管。（Reddy et al., 2014; Riva-Cambrin et al., 2016）

PHH的管理充满并发症。大约40%的脑室-腹腔分流管在植入后两年内出现故障，需要手术修复。每次分流管故障都会伴随显著的发病率和死亡风险。（Nejat et al., 2008; Reddy et al., 2014; Riva-Cambrin et al., 2016; Robinson, 2012; Shannon et al., 2012）尽管外科干预可以缓解脑积水症状和相关的白质损伤，但目前尚无获批的药物治疗方法可以降低GMH后的PHH风险。

鉴于脑积水在GMH事件后出现的延迟，长期以来人们认为出血引起的组织炎症反应是导致脑积水发展的原因。在类似的脑损伤（如创伤性脑损伤或中风）中，神经炎症反应会引发继发性损伤。在GMH的情况下，这种继发性损伤会扩展到周围神经组织，因为神经毒性化合物会释放到脑室系统中，导致血脑屏障破坏和邻近神经血管受损。（Ballabh, 2014; Garton et al., 2017）

已经开发了几种临床前模型来研究获得性脑积水，包括向脑室内注射胶原酶（Jinnai et al., 2020）、甘油（Cheng et al., 2023, Finkel et al., 2023）或血液（Marinkovic et al., 2014, Mishra et al., 2025, Peterson et al., 2022）；向腹腔内注射甘油（Ballabh et al., 2007, Conner et al., 1983, Georgiadis et al., 2008, Purohit et al., 2021）；以及向神经节隆起（相当于小鼠的胚基基质）注射胶原酶（Alshareef et al., 2022, Flores et al., 2016, Leitzke et al., 2013, Lekic et al., 2016, Lekic et al., 2012, Lekic et al., 2011, Li et al., 2023, Xu et al., 2020）。在这些方法中，神经节隆起胶原酶（GEC）模型产生的胚基基质损伤最为一致和可重复，表明该模型中驱动脑积水形成的病理机制最接近于早产婴儿GMH后的实际情况。在小鼠中模拟胚基基质损伤时，使用出生后第2-4天的动物是合适的，因为这一发育阶段在生物学上相当于人类新生儿的大约26周胎龄（McCarthy et al., 2018），这一时期的婴儿发生GMH的风险极高。（Ballabh, 2014; Kochanek et al., 2012; Osterman et al., 2015）

已经建立了一种用于在大鼠中模拟胚基基质损伤及随后PHH的GEC模型（Lekic et al., 2011），并得到了广泛的应用（Flores et al., 2016, Leitzke et al., 2013, Lekic et al., 2012, Lekic et al., 2016, Li et al., 2023, Xu et al., 2020）。后续的研究将这种方法扩展到了小鼠身上；然而，这些初步研究采用了手动注射技术，且使用的胶原酶剂量远高于先前大鼠模型中的体重调整剂量（Alshareef et al., 2022）。

我们的最终目标是研究转基因小鼠品系中的GMH相关组织损伤和PHH的发生机制，因此我们试图在此基础上确定一种优化的胶原酶剂量策略，以实现强烈的脑积水诱导效果，同时尽量减少操作并发症。为了提高重复性，小鼠GMH/PHH模型采用了精确的立体定向注射坐标。

部分内容片段

小鼠中基于体重的梭菌胶原酶等效剂量定义

根据已建立的大鼠模型，将VII-S型梭菌胶原酶的基于体重的等效剂量进行了调整。（Flores et al., 2016, Leitzke et al., 2013, Lekic et al., 2016, Lekic et al., 2012, Lekic et al., 2011, Li et al., 2023, Xu et al., 2020）研究发现，对于新生小鼠幼崽，等效剂量为0.024 CDU / μL，这被称为“中等剂量”（MD）。该剂量用于评估脑积水诱导率并生成脑室扩大的剂量-反应曲线。

讨论

GMH的发生率约为每1,000例活产婴儿中的3.5例，其中PHH是主要的神经学后遗症。（Ballabh, 2014, Kochanek et al., 2012, Osterman et al., 2015）1990年首次在大鼠中建立了由胶原酶引起的脑内出血模型。（Rosenberg et al., 1990）最近，通过将胶原酶立体定向注射到神经节隆起中，开发了一种大鼠GMH/PHH模型。（Lekic et al., 2011）迄今为止，只有一项研究报道了在小鼠中进行的GEC注射（Alshareef et al., 2022）

PBS的立体定向注射可能导致新生小鼠脑室扩大

在注射后14天分析脑室体积时，观察到两只对照组小鼠出现了轻微的脑室扩大（图3C-D）。其中一只动物在注射后14天的VI测量中也显示出脑室扩大，并且在注射后28天的LV体积增加（图3A, D）。免疫荧光分析显示了一些脑室周围组织损伤，包括注射部位和同侧脑室内的血液产物（补充图2）。因此

关键资源

试剂或资源	来源	标识符
化学品和抗体	空白单元格	空白单元格
来自Clostridium histolyticum的VII-S型梭菌胶原酶	Sigma-Aldrich	C2399
磷酸盐缓冲盐水（PBS），1x溶液	Gibco	14190144
4%甲醛，溶于PBS	Invitrogen	J61899.AK
pH 6.0柠檬酸缓冲液	Millipore Sigma	21545
抗GFAP抗体	abcam	ab7260
CD68单克隆抗体	Invitrogen	MA5-13324
BlockAid?封闭溶液	Invitrogen	B10710
Alexa Fluor? 488	Invitrogen	A-11034
Alexa Fluor 555	Millipore Sigma	SAB4600066
fluoromount-G，DAPI

补充信息

图S1，MRI数据标注

图S2，局限性

图S3，图4的补充内容

生成式AI和AI辅助技术的声明

作者声明本研究中未使用任何生成式AI和AI辅助技术。

资金支持

本研究得到了LeVecke家族基金会和CHOC CSO小额资助计划（CSO 244）的支持。

CRediT作者贡献声明

伊芙琳·托雷斯（Evelyn Torres）：资源提供、方法论设计、实验实施。亚历杭德拉·帕迪利亚（Alejandra Padilla）：资源提供、方法论设计、实验实施。迈克尔·勒（Michael Le）：数据分析、数据管理。斯宾塞·萨巴哈特（Spencer Sabahat）：数据可视化、实验实施。莱安德罗·卡斯塔涅拉-鲁伊斯（Leandro Casta?eyra-Ruiz）：写作——审稿与编辑、项目监督、方法论设计、实验实施、数据分析、概念构思。诺亚·拉莫斯（Noah Ramos）：写作——审稿与编辑、数据可视化、验证、实验实施。迈克尔·穆霍宁（Michael Muhonen）：写作——审稿与编辑、验证

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

我们感谢安东尼·兰格尔（Anthony Rangel）对我们工作的持续技术支持和后勤协助。

资源获取

如需进一步信息或资源，请联系主要联系人：吉奥·吉森（[e-mail]）和莱安德罗·卡斯塔涅拉-鲁伊斯（[e-mail]）。

机构协议

动物实验遵循CHOC IACUC-24-004协议进行。

利益冲突声明

作者声明没有已知的竞争性利益或个人关系可能影响研究结果。