《Microchemical Journal》：Establishment of a simultaneous UPLC–MS/MS method for heterocyclic aromatic amines in tea
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本研究建立了基于UPLC-MS/MS的茶叶中杂环芳胺（HAAs）的同时分析方法，优化了提取溶剂和条件，定量限为0.1-5.9 μg/kg，加标回收率50-101%（n=3），RSD<16%。评估了6种茶类的基质效应（-87%~72%），并应用于22份市售茶样检测，发现均含有哈曼和诺哈曼，27%检出Trp-p-1。该方法灵敏度高、通量大，为茶叶安全检测提供新方案。
孙和志|史海新|张新忠|罗凤健|陈宗茂|周莉
中国农业科学院茶叶研究所，中国杭州310008
摘要
本文建立了一种利用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC–MS/MS）同时分析茶叶中杂环芳香胺（HAAs）的方法。为了提高检测灵敏度，优化了提取溶剂和提取方法。测试样品中HAAs的定量限（LOQ）范围为0.1–5.9 μg kg?1。在1、10、100 μg kg?1浓度下的回收率均处于50–101%之间（n = 3），相对标准偏差（RSD）低于16%，表明该方法具有较好的准确性。研究了六种不同类型茶叶中的基质效应，其范围为?87%至72%，具体数值因茶叶种类和HAAs种类而异。随后将该分析方法应用于22个实际市场茶叶样品的检测，所有样品均含有哈曼（harman）和诺哈曼（norharman），其中27%的样品还含有Trp-p-1。本研究提供了一种灵敏度高、通量大的方法用于检测茶叶中的HAAs。
引言
杂环芳香胺（HAAs）是一类含有氮杂环的多环芳香化合物，具有致癌和致突变作用[1]、[2]。截至目前，已分离并鉴定出30多种HAAs[3]。其中，2-氨基-3-甲基咪唑[4,5-f]喹诺酮（IQ）被国际癌症研究机构（IARC）列为可能的人类致癌物（2A类）[4]，另外12种HAAs，包括2-氨基-3,4-二甲咪唑[4,5-f]喹诺酮（MeIQ）和2-氨基-3,8-二甲咪唑[4,5-f]喹诺酮（MeIQx），被列为可能的人类致癌物（2B类）[5]。HAAs广泛存在于食品[6]、饮料[7]、[8]、燃烧烟雾[9]、大气[10]、河水中[11]等。人类主要通过饮食摄入HAAs，尤其是通过富含蛋白质的食物[12]，如加热处理的肉类和鱼类。茶叶中的HAAs主要通过一系列反应生成，包括美拉德反应、缩合反应和环化反应，这些反应涉及肌酸酐、氨基酸和还原糖等内源性物质，在高温条件下发生[13]、[14]、[15]。
由于茶叶中含有丰富的多酚[16]、[17]，多酚提取物[18]、[19]已被用于抑制肉类热加工过程中HAAs的生成，通过捕获斯特雷克醛或消除自由基中间体。抑制效果受底物（如鸡肉、牛肉、猪肉）、加热方式（如方法、温度、时间）以及抗氧化剂（如剂量和组成）的影响[20]。然而，尽管茶叶本身含有大量蛋白质（干基含量21–28%[21]），但在绿茶和红茶的热加工过程中仍会产生HAAs。作为国内和海外最受欢迎的非酒精饮料之一，茶叶的安全性至关重要。因此，有必要确定茶叶中HAAs的存在情况并分析其分布特征。
为了检测HAAs，已开发了多种基于液相色谱（LC）或气相色谱（GC）的方法[22]。与LC联用的常见检测器包括质谱（MS）、二极管阵列检测器（DAD）、荧光检测器、紫外-可见光检测器等；与GC联用的检测器包括火焰离子化检测器（FID）、氮磷检测器（NPD）等。由于HAAs的理化性质，LC的应用更为广泛。从样品分析的角度来看，现有的HAAs检测方法主要针对加热处理的肉类产品，仅有少数研究关注加热处理的植物产品，如中药[23]、咖啡[8]、[24]、[25]和茶叶[19]。然而，现有的茶叶HAAs检测方法在提取过程中需要消耗大量的有机溶剂和纯化材料（例如每个样品需使用100 mL乙酸乙酯和13 g硅藻土）。因此，本研究旨在建立一种节省溶剂和纯化材料的替代检测方法，以更好地监测商业茶叶样品中的HAAs（图1）。
方法部分
化学试剂
杂环芳香胺混合标准品（浓度100 μg mL?1）和甲酸（纯度98%，HPLC级）购自Alta Scientific有限公司（中国天津）。甲醇（MeOH）和乙腈（MeCN，HPLC级）购自默克公司（德国达姆施塔特）。水购自 Wahaha集团有限公司（中国杭州）。氨水（浓度25.0–28.0%）、盐酸（浓度36.0–38.0%）和乙酸（分析级）由上海测试四惠化工有限公司（中国上海）和新华药业集团有限公司提供。样品制备
为了开发一种简单、灵敏且高效的样品提取方法，对提取条件进行了优化。根据以往的研究，通常使用三种不同的溶剂进行HAAs的提取：MeOH/水（1/1，v/v）、含1%乙酸的MeCN/水（10/3，v/v）以及MeCN/1 M NaOH水溶液（6/3，v/v），分别对应中性、酸性和碱性提取条件。通过三组回收率实验比较了这些溶剂的提取效果。结论
本研究利用UPLC–MS/MS建立了一种同时检测茶叶中HAAs的方法，并对其进行了验证。确定了最佳提取条件和基质效应。与以往的茶叶检测方法相比，该方法具有溶剂消耗量低、实验设置简单的明显优势。此外，该验证方法还被应用于22个实际茶叶样品的常规分析，检测结果证实样品中存在哈曼、诺哈曼和Trp-p-1。本研究不仅提供了一种新的检测方法
作者贡献声明
孙和志：撰写初稿、数据可视化、项目管理、方法设计、资金申请、概念构思。史海新：数据可视化、方法验证、实验设计、数据分析。张新忠：软件开发、实验协助。罗凤健：软件支持、资源协调。陈宗茂：撰写、审稿与编辑、实验监督。周莉：撰写、审稿与编辑、实验监督、资金申请。
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本研究结果的已知财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了国家重点研发计划（项目编号：2021YFD1601101；2022YFD16000803）和中国农业科学院创新计划（CAAS ASTIP-TRICAAS）的支持。
