《Microchemical Journal》：Label-free, cell-based electrochemical cytotoxicity profiling on poly-
l-lysine -functionalized screen-printed electrodes with image-validated partial blockage modeling
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无标记差分脉冲伏安法（DPV）通过聚-L-赖氨酸修饰电极实现细胞毒性动态评估，建立细胞覆盖度与DPV电流衰减的定量关系模型，验证两种细胞系在阿霉素处理下的差异响应，并排除药物与探针的直接干扰。
哈斯雷特·图尔克曼（Hasret Turkmen）
土耳其伊兹密尔凯蒂普·塞莱比大学（?zmir Katip Celebi University），纳米科学与纳米技术系
摘要
无标记电化学细胞毒性检测方法为基于染料的检测方法提供了有吸引力的替代方案。然而，活细胞表面覆盖度与电化学响应之间的定量关系通常仅被定性分析。在这里，我们报道了一种集成在培养皿中的聚赖氨酸（Poly-Lysine, PLL）功能化丝网印刷碳电极（PLL@SPCE-Petri），用于基于差分脉冲伏安法（Differential Pulse Voltammetry, DPV）的时间和剂量依赖性细胞毒性分析。活细胞/死细胞荧光图像被处理以量化活细胞覆盖度（θ_live），而铁氰化物氧化还原对则提供了稳健的无标记读数，用于检测细胞引起的界面阻塞。通过一个简洁的部分阻塞模型，将归一化的DPV峰电流（I/I_0）与θ_live定量关联，从而提取出PLL@SPCE细胞界面的特定于平台的有效阻塞系数（β）。在多柔比星（Doxorubicin, DOX）作用下，SH-SY5Y和L929细胞表现出不同的I/I_0-θ_live行为，这与细胞系的粘附（附着和扩散）和形态有关。干扰实验确认，在测量条件下DOX并未显著干扰[Fe(CN)_6^3-/4-探针的信号。总体而言，PLL@SPCE-Petri提供了一个可重复的分析框架，将图像衍生的覆盖度指标与DPV特征相结合，用于基于机制的无标记细胞毒性评估，并为未来的机器学习数据生成做好准备。
引言
电化学传感在体外生物检测中因其灵敏度和与复杂基质的兼容性而脱颖而出[1]。电化学方法的非破坏性和体外兼容性也使它们适用于基于细胞的检测，包括细胞毒性的电化学评估[2]。电化学检测能够探测细胞的氧化还原特性，从而推动了体外平台的发展[3],[4]。借助基于电化学的生物传感器，近年来对活细胞的毒性评估和早期诊断的研究变得非常普遍[5],[6]。尽管细胞级传感技术面临相当大的挑战[7],[8]，但基于细胞的生物传感器是一种灵敏且可靠的测量细胞活力的方法[8]。快速、可重复且非破坏性的基于细胞的细胞毒性测量对于基础生物学和药物筛选至关重要。虽然基于终点的比色法（如MTT）很常见，但它们的样品消耗、多步骤协议要求以及有限的实时监测能力是重要的限制。相比之下，无标记电化学基于细胞的传感器通过直接读取细胞-电极界面处的电荷转移和代谢过程，提供了时间特异性的毒性检测潜力，最近的综述和应用表明这种方法在评估细胞能量代谢和药物效应方面已经成熟[9]。丝网印刷碳电极（SPCE）以其低成本、便携性和适合大规模生产而著称。外层氧化还原对（如铁氰化物[Fe(CN)_6^3-/4-）为验证扩散控制传输和通过Randles–?ev?ík关系校准电极性能提供了标准参考。在这种背景下，差分脉冲伏安法（DPV）由于其高信噪比，能够灵敏地检测到细胞存在时产生的电子转移屏障中的微小电流变化[10]。DPV信号的生物物理基础也得到了更好的阐明：从细胞外部测量的电化学信号据报道基于代谢反应，并与内在的ATP/细胞活力高度相关[11]。细胞在电极表面的有效粘附对于生物相容性和测量稳定性至关重要。聚赖氨酸（PLL）涂层通过带正电的胺基增强粘附，从而加强了细胞-电极界面处的电荷/质量转移屏障，这些变化可以在电化学阻抗谱（EIS）和伏安输出中定量监测[12],[13]。在不同的基于电化学的细胞毒性评估示例中，已成功应用了基于分泌的功能读数（例如，使用AuNPs/MWCNTs/SPE监测外泌多巴胺）或基于阻抗的实时监测（ECIS/EIS）[14],[15]。也有报道指出，通过EIS在HepG2金属表面上检测到肝毒素，并通过传统的终点检测方法得到确认[16]。最近，还发布了关于无介质的细胞上电化学分析方法和活细胞生物阻抗实验可重复性的方法指南[17],[18]。另一方面，多柔比星（DOX）是一种已建立的模型药物，通过多种机制发挥细胞毒性作用，如DNA插入、拓扑异构酶II抑制和ROS产生。这种特性适用于比较不同细胞系中的时间-剂量动态[19]。文献中还报道了基于DPV的无标记毒性传感器在农药/药物评估中的应用[20]。本研究介绍了一种简单的PLL@SPCE架构，该架构与培养皿集成，实现了时间和剂量分辨的无标记DPV细胞毒性分析。该方法的主要优点包括易于设置、快速读数、两种细胞系的比较分析以及清晰的干扰控制。该系统首先在无细胞条件下使用参数依赖性和重复性测试对[Fe(CN)_6^3-/4-介质进行了验证。随后，使用扫描速率CV电化学评估了PLL表面上由部分电极覆盖引起的细胞诱导的界面效应，以验证扩散控制行为并估计表观电活性可及面积（A_eff,app），同时使用DPV作为主要读数来监测时间和剂量依赖的毒性。
结果证明了在PLL@SPCE-Petri培养皿架构中，无标记、时间和剂量分辨的DPV毒性分析方法在两种细胞系中的方法学上的合理性，θ_live-I/I_0关系得到了实验验证。
本工作的主要贡献可以总结如下：
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使用图像衍生的活细胞覆盖度对部分电极阻塞模型进行了定量验证：从荧光显微镜图像中量化θ_live，并直接将其与PLL功能化丝网印刷碳电极（PLL@SPCE-petri培养皿）上的归一化DPV响应（I/I_0）相关联。这使我们能够建立并实验校准一个针对粘附活细胞的分析部分阻塞模型，包括提取特定于PLL@SPCE细胞界面的阻塞系数。
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在PLL@SPCE上进行无标记、时间和剂量分辨的细胞毒性分析：通过DPV无标记地监测DOX在SH-SY5Y和L929细胞系中的细胞毒性，作为暴露时间和药物浓度的函数。该平台提供了一种可重复的、接近实时的替代方法，用于替代传统的终点检测方法，如MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯四唑溴化物）和Live/Dead。
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在电化学读数中展示了细胞系的特异性粘附和形态效应：通过图像分析捕捉到SH-SY5Y和L929细胞之间的粘附和形态差异，并反映在不同的I/I_0-θ_live关系和DPV趋势中，揭示了在同一PLL@SPCE平台上的细胞系依赖性部分阻塞行为。
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控制DOX-氧化还原探针的相互作用以确保信号特异性：进行了控制实验，以评估DOX与[Fe(CN)_6^3-/4-氧化还原对之间的直接电化学相互作用，确认观察到的电流变化主要源于细胞诱导的阻塞，而不是药物探针的干扰。
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为未来的AI辅助、图像感知电化学细胞毒性分析提供了基础：通过联合获取定量图像描述符和DPV特征，本研究建立了一个数据结构和概念框架，可以扩展到机器学习或深度学习模型，用于未来的AI辅助、无标记细胞毒性预测。
大多数报道的基于细胞的电化学毒性传感器主要在定性水平上描述了细胞覆盖度与电化学信号之间的关系。在这里，我们假设在PLL功能化的丝网印刷碳电极（PLL@SPCEs）上，活细胞表面覆盖度的增加（θ_live）通过部分电极阻塞/污染机制导致I/I_0的可预测下降，这种关系可以通过细胞系和界面依赖的污染系数（β）来定量捕获。基于这一假设，我们回答了以下问题：(i) θ_live能否定量解释不同时间点测量的DPV信号衰减？(ii) 是否可以从结合了图像-电化学数据集中可靠地提取β，并具有可验证的拟合标准和不确定性范围？以及(iii) PLL@SPCE-Petri架构能否在DOX作用下为两种不同细胞系提供时间和剂量敏感的细胞毒性谱？在这个背景下，我们提出了一个定量部分阻塞模型，将图像衍生的θ_live信息与I/I_0相关联，并允许为PLL-SPCE界面推导出特定于细胞系和界面的β系数。
材料与设备
磷酸盐缓冲盐水（PBS）、铁氰化钾（K_4[Fe(CN)_6）、铁氰化钾（K_3[Fe(CN)_6）和聚赖氨酸（PLL，0.1% w/v在H_2O中）从Sigma-Aldrich（美国）购买。多柔比星盐酸盐（DOX）来自Sigma-Aldrich（分析级）。胎牛血清（FBS）、青霉素-链霉素和Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM，高葡萄糖）来自Gibco（美国）。SH-SY5Y（人神经母细胞瘤）和L929（小鼠成纤维细胞）细胞系来自ATCC
结果与讨论
在富含蛋白质的培养基中，非特异性吸附/生物污染会减弱氧化还原探针的电流，使得在长时间孵育期间的解释变得困难。这些限制和常见的缓解策略（表面抗污染层、阻断剂和仔细的参考）在电化学生物传感器文献中有详细记录[40]。类似的基于氧化还原介质的电化学定量方法在复杂的生物基质中突显了...
结论
本研究展示了一个基于PLL功能化的SPCE平台，用于使用[Fe(CN)_6^3-/4-氧化还原探针进行快速、无染料、时间和剂量分辨的细胞毒性分析。与部分电极阻塞框架一致，DPV峰电流随着细胞密度的增加而降低，在L929中的衰减比在SH-SY5Y中更为明显，这可能反映了细胞系的特定附着/扩散和在电极表面的空间组织（簇/边缘几何形状）。在时间-剂量实验中...
CRediT作者贡献声明
哈斯雷特·图尔克曼（Hasret Turkmen）：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿，可视化，验证，软件，资源，方法学，研究，资金获取，形式分析，数据管理，概念化。
伦理声明
本研究未使用人类参与者、动物或可识别的人类数据。实验使用从授权仓库获得的已建立的细胞系（L929和SH-SY5Y）进行，并按照机构生物安全指南进行处理。因此，不需要伦理批准和知情同意。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系，这些关系可能影响本文报告的工作。
致谢
我衷心感谢我的博士后导师穆斯塔法·申教授（?zmir Katip Celebi大学）和博拉·布格拉·塞泽尔博士（Ege大学）提供的宝贵指导和支持。
