《Mitochondrion》：Impact of compound heterozygous
SDHA variants on mitochondrial function in pediatric with neurological disease
编辑推荐：
本研究针对一名携带SDHA基因c.1535G>A (p.R512Q) 和 c.1753C>T (p.R585W)复合杂合变异的儿科神经疾病患者，通过功能实验深入探索了这些变异对琥珀酸脱氢酶（SDH/CII）活性、线粒体呼吸链（MRC）组装和功能的致病性影响，首次为这两种变异的功能丧失提供了直接证据，并揭示了其对复合物I（CI）功能的连锁影响，强调了功能研究在重新评估意义未明变异（VUS）和解析线粒体疾病机制中的关键作用。
在我们身体每一个细胞的“能量工厂”——线粒体中，一场高效的能量转换工程持续进行着。这个过程的核心是氧化磷酸化（OXPHOS）系统，它由线粒体呼吸链（MRC）的五个蛋白复合物（CI到CV）协同完成。其中，复合物II（CII），也称为琥珀酸脱氢酶（SDH），扮演着独特而关键的双重角色：它不仅是MRC的成员，负责传递电子，还是三羧酸循环（Krebs cycle）的关键酶，负责催化琥珀酸转化为延胡索酸。SDH由四个亚基（SDHA, SDHB, SDHC, SDHD）组成，其中SDHA是主要的催化亚基。编码SDHA的基因若发生致病突变，可导致先天性线粒体功能障碍，引发一系列严重的神经系统疾病，如Leigh综合征，也与某些肿瘤的发生风险增加相关。然而，许多在患者中发现的SDHA基因变异，其致病性尚未通过功能实验得到确凿验证，这为精准诊断和深入理解疾病机制带来了挑战。
近期，发表于《Mitochondrion》的一项研究，正是为了应对这一挑战。研究者聚焦于在一名患有癫痫、发育迟缓和视神经萎缩的14岁儿科患者中鉴定出的两个罕见SDHA复合杂合错义变异：c.1535G>A (p.R512Q) 和 c.1753C>T (p.R585W)。尽管这两个变异此前已有零星报道，与原发性线粒体病（PMD）及副神经节瘤（PGL）、胃肠道间质瘤（GIST）等肿瘤相关，但其对线粒体功能的直接影响从未被阐明。本研究旨在通过功能实验，首次系统评估这些变异对SDH功能、MRC组装及细胞呼吸能力的实际影响，从而确认其致病性，并为理解相关临床表型提供分子基础。
研究人员主要运用了以下几项关键技术方法：首先，利用针对133个OXPHOS系统相关基因的定制化下一代测序（NGS）面板对患者进行基因检测，并结合Sanger测序进行家系共分离验证。其次，采集患者的皮肤成纤维细胞进行体外培养，作为研究模型。在功能层面，通过分光光度法检测了线粒体呼吸链各复合物（CI, CII, CIII, CIV）的酶活性。接着，使用Seahorse细胞能量代谢分析仪测量了细胞的耗氧率（OCR），以评估线粒体呼吸功能参数，如基础呼吸、最大呼吸、备用呼吸容量等。最后，通过蛋白质免疫印迹（Western blot）分析了线粒体蛋白提取物中各呼吸链复合物亚基的蛋白表达水平，并利用蓝色原生胶电泳（BN-PAGE）技术分析了呼吸链复合物及其超级复合物（SCs，如呼吸体）的组装状态。
3.1. Genetic findings
研究者通过靶向NGS测序，在患者中鉴定出SDHA基因的两个复合杂合错义变异。生物信息学分析显示，这两个变异在人群数据库中频率极低，多种致病性预测工具均提示为有害，且影响的氨基酸在进化上高度保守。家系分析证实，两个变异分别遗传自父母，符合复合杂合遗传模式。根据美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）指南，c.1753C>T变异被归类为致病性，而c.1535G>A则被归类为意义未明（VUS），这凸显了功能验证的必要性。
3.2. Analysis of the activity of the MRC complexes
对患者成纤维细胞的酶活检测揭示了明确的生化缺陷。与对照组相比，患者细胞的琥珀酸脱氢酶（CII）活性显著降低至对照组的28.6%。值得注意的是，复合物I（CI）的活性也降低了约36%。然而，复合物III（CIII）和复合物IV（CIV）的活性则保持正常。这种CII和CI活性的联合缺陷在骨骼肌样本中并未观察到CI的降低，提示了组织特异性。进一步的细胞呼吸功能分析带来了一个出人意料的结果：患者细胞的基础耗氧率和最大耗氧率与对照相比并无显著差异，但其备用呼吸容量（spare respiratory capacity）却出现了显著下降。这表明，在静息状态下细胞的能量供应尚可维持，但在应对能量需求激增的压力时，其储备能力严重不足。
3.3. Analysis of the assembly of the MRC complexes
为了探究活性下降的结构基础，研究者分析了线粒体蛋白的表达与组装。蛋白质免疫印迹结果显示，患者细胞中所有SDH亚基（SDHA, SDHB, SDHC, SDHD）的稳态蛋白水平均下降，其中SDHC几乎检测不到。同时，CI的一个亚基NDUFA9的水平也降低，而CIII、CIV和CV（ATP合酶）的亚基水平正常。这提示变异导致SDHA蛋白不稳定，进而影响了整个CII的组装和稳定性，并对CI的稳定性产生了连锁影响。蓝色原生胶电泳（BN-PAGE）分析直观地展示了组装缺陷：患者细胞中CII的组装显著减少，同时，含有CI的超级复合物（特别是呼吸体CI+CIII2+CIVn）的丰度也显著降低。而CIII和CIV的组装状态则相对正常。
3.4. Reclassification of pathogenicity of SDHA variant
基于上述功能研究提供的明确证据，即两种SDHA变异导致了CII功能丧失、组装缺陷以及对CI的次级影响，研究者得以应用ACMG指南中的PS3标准（功能研究）对变异进行重新分类。c.1535G>A (p.R512Q) 变异从“意义未明”被重新分类为“可能致病”，而c.1753C>T (p.R585W) 变异的“致病性”分类则得到了实验数据的强有力支持。
讨论与结论
本研究首次对SDHA基因c.1535G>A和c.1753C>T这一对复合杂合变异进行了全面的功能验证，证实了它们的致病性。研究发现，这些变异不仅导致SDH/CII的活性和组装严重受损，还出人意料地引起了复合物I（CI）活性下降和CI-containing超级复合物的组装减少，揭示了CII缺陷对上游电子传递链的“跨复合物”影响。尽管存在这些显著的分子缺陷，患者成纤维细胞的基线呼吸功能却得以维持，其主要的能量代谢损害体现在“备用呼吸容量”的显著降低上。这意味着细胞应对突发能量需求的能力受损，这可能部分解释了为何患者表现为相对缓慢进展的神经症状，而非急性致命性的能量危机。
这项研究具有多重重要意义。首先，它通过严谨的功能实验，为两个临床报道的SDHA变异提供了直接的致病性证据，成功将其中一个VUS升级为“可能致病”，这为患者的精准基因诊断和遗传咨询提供了关键依据。其次，研究揭示了SDHA缺陷可能导致超越CII本身的、更广泛的线粒体呼吸链功能障碍（特别是涉及CI），深化了我们对SDH相关线粒体病病理机制的理解。这种组织特异性（成纤维细胞缺陷明显而肌肉组织CI活性正常）和代谢适应性（基础呼吸保留而备用容量下降）的发现，提示了不同组织在应对同一遗传缺陷时可能采取不同的代谢补偿策略。最后，该研究强调，对于表现为神经发育障碍、癫痫和视神经萎缩的儿科患者，即使不符合典型的严重Leigh综合征，也应将SDHA缺陷纳入鉴别诊断范畴，并且功能验证是解析基因变异临床意义不可或缺的一环。这些发现不仅增进了对SDHA相关疾病谱的认识，也为未来探索针对此类线粒体功能障碍的潜在治疗策略奠定了基础。
