《Chemistry & Biodiversity》：Chemical Constituents of Taxodium mucronatum (Cupressaceae) and Some of Its Endophytic Fungi, and Their In Silico and In Vitro Evaluations as SARS-CoV-2 Inhibitors and as Cytotoxic Agents
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本研究对墨西哥传统药用植物——墨西哥落羽杉（Taxodium mucronatum）及其内生真菌进行了系统的化学与生物学评价。通过传统生物技术与化学分析，从植物不同部位（果实、枝叶）中分离得到20个化合物，包括二萜、环阿屯烷型三萜及甾醇；从内生真菌（主要为青霉菌属Penicillium）中亦分离得到多种次生代谢产物。运用PASS（Prediction of Activity Spectra for Substances）软件进行计算机模拟预测，并对部分化合物进行了体外抗病毒（抑制SARS-CoV-2 Spike蛋白与ACE2结合）及抗肿瘤活性评价。结果表明，墨西哥落羽杉及其内生真菌是抑制SARS-CoV-2病毒侵染（如taxodione）和抗特定肿瘤细胞系（如taxoquinone, curvularin, mycophenolic acid）的生物活性物质的潜在新来源，为理解植物-微生物互作及其协同产生生物活性成分提供了新见解。
墨西哥落羽杉及其内生真菌的化学与生物活性研究全景
引言
植物天然产物是新药研发的重要宝库，然而，对其内生真菌及其次生代谢产物的了解则相对有限。理解植物与其内生真菌之间的关系，是探索这一共生体系生物合成潜力的第一步。以从短叶红豆杉（Taxus brevifolia）及其内生真菌安德烈紫杉霉（Taxomyces andreanae）中均发现抗癌药物紫杉醇（taxol）为例，充分表明了同时探索植物与真菌源代谢物的重要性。本研究聚焦于墨西哥落羽杉及其内生真菌的化学成分研究与生物活性评价。该树种分布于美国南部、墨西哥全境及危地马拉北部，在当地被称为“ahuehuete”（纳瓦特尔语，意为“永不衰老的树”），其果实、枝条、叶片等在墨西哥传统医学中用途广泛，可用于愈合伤口溃疡、止痛、通便、治疗呼吸道感染以及作为通经剂和利尿剂。已有报道显示，墨西哥落羽杉提取物具有血管舒张、降血糖、抗菌和抗真菌等活性。为继续探寻墨西哥生物区系中的活性化合物，本工作旨在丰富对墨西哥落羽杉不同部位（果实、枝条、叶片）的化学与生物学认知，鉴定其内生真菌，并分离、评估由这些微生物产生的化学成分的生物活性。
结果与讨论
内生真菌的鉴定
从墨西哥落羽杉树皮中共分离出26株可培养丝状真菌，通过内部转录间隔区（Internal Transcribed Spacer, ITS）rDNA序列分析，鉴定出17个不同物种。基于BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）结果，rDNA ITS序列被归入子囊菌门（Ascomycota）。优势菌属为青霉菌属（Penicillium），共6个种；其次为链格孢属（Alternaria）、镰刀菌属（Fusarium）、枝孢属（Cladosporium）、弯孢属（Curvularia）各2个种；以及革盖菌属（Gloeophyllum）、暗色壳属（Phaeoacremonium）和Seiridium属各1个种。这些结果已提交至NIH GenBank数据库。基于ITS1和ITS4序列分别构建的系统发育树显示，这些内生真菌的遗传关系可能反映了它们与宿主植物的共进化，即生活在同一植物上的微生物之间遗传相似性更高，而非仅因属于同一属。
值得注意的是，菌株NMD1被鉴定为Seiridium ceratosporum，NMX3为Gloeophyllum trabeum，NM24和NM25为Phaeoacremonium iranianum，这些均曾被报道为植物病原真菌。然而，采集的植株并未表现出肉眼可见的病害，这可能是因为某些内生真菌产生了抑制这些病原菌生长的次生代谢物，从而防止了病害的发生。
墨西哥落羽杉及其内生真菌的化学成分
对墨西哥落羽杉果实的正己烷-氯仿（1:1）提取物进行分析，分离得到松香烷型二萜类化合物：罗汉松醌（royleanone, 1）、落羽杉醌（taxoquinone, 2）、落羽杉二酮（taxodione, 3）、柳杉酚（sugiol, 4）和5,6-去氢柳杉酚（5,6-dehydrosugiol, 5）。其中，落羽杉醌（2）是果实提取物中的主要成分，此前已被报道具有抗真菌、抑制α-葡萄糖苷酶和酪氨酸酶、细胞毒性、抗H1N1流感病毒及抗氧化等多种生物活性。柳杉酚（4）存在于果实和枝条中，可被视为落羽杉属的特征性代谢物，具有细胞毒性和抗炎活性。
对叶片的研究分离得到β-谷甾醇（β-sitosterol, 11）、8β-羟基海松-15-烯-19-酸（8β-hydroxypimar-15-en-19-oic acid, 6）、环马烯醇（cyclomargenol, 7）、24-亚甲基环木菠萝烯醇（24-methylenecycloartanol, 8）、环马烯酮（cyclomargenone, 9）和24-亚甲基环木菠萝烯酮（24-methylenecycloartenone, 10）。其中，环阿屯烷型三萜（7-10）是首次从该物种中报道。环马烯醇（7）曾被报道可降低COX1和COX2的活性。对枝条的分析则分离得到柳杉酚（4）、β-谷甾醇（11）和β-谷甾醇-β-D-吡喃葡萄糖苷（β-sitosteryl-β-D-glucopyranoside, 12）。
从部分可培养内生真菌中分离得到的代谢产物包括：来自Penicillium crustosum（NM1）的弯孢霉菌素（curvularin, 13）；来自P. roseopurpureum（NMB, NMY4）和P. sumatraense（NM3-2A）的去氢弯孢霉菌素（dehydrocurvularin, 14）；来自P. sumatraense（NM3-2A）的11α-羟基弯孢霉菌素（11α-hydroxycurvularin, 15）和11β-羟基弯孢霉菌素（11β-hydroxycurvularin, 16）；来自P. roseopurpureum（NMB）的霉酚酸（mycophenolic acid, 17）和去甲基霉酚酸（demethylmycophenollic acid, 18）；来自P. commune（NM16A2）的麦角甾醇（ergosterol, 19）；以及来自Cladosporium cladosporioides（NMX4）的酪醇（tyrosol, 20）。大环内酯类化合物13-16以其抗真菌活性和细胞毒性为特征，而霉酚酸衍生物18则被报道为抗菌剂。
抗病毒活性谱预测与SARS-CoV-2 Spike蛋白:ACE2复合物抑制活性评价
通过PASS在线平台预测了化合物1-20作为流感病毒和鼻病毒抑制剂的活性概率（Pa）。结果显示，5,6-去氢柳杉酚（5）和β-谷甾醇-β-D-吡喃葡萄糖苷（12）对流感病毒的Pa > 0.7。而对鼻病毒Pa > 0.7的三萜是24-亚甲基环木菠萝烯醇（8, Pa 0.746）。
在体外实验中，测试了化合物2-7、9、11和13抑制SARS-CoV-2 Spike蛋白与ACE2受体形成复合物的能力。落羽杉二酮（3）表现出最高的抑制率（48.08%），其次是8β-羟基海松-15-烯-19-酸（6, 40.19%）和柳杉酚（4, 28.57%）。尽管PASS预测使用的模型是流感病毒和鼻病毒，但一些松香烷二萜（如柳杉酚4）已被报道可作为其他SARS-CoV病毒的抑制剂。
细胞毒性活性谱预测与评价
PASS预测显示，化合物2-9和17-19诱导细胞凋亡的Pa > 0.7；而化合物1-3、7-9和13-19则显示出突出的抗肿瘤活性潜力。
选取化合物2、4、5-7、9、13和17，针对中枢神经系统（U251）、前列腺（PC-3）、白血病（K562）、结肠（HCT-15）、乳腺癌（MCF-7）和肺癌（SK-LU-1）六种人肿瘤细胞系进行了细胞毒性测试。化合物2、5、13和17对六种肿瘤细胞系的生长抑制率均超过50%。落羽杉醌（2）对U251细胞的抑制活性最高（87.91%），且在10 μM浓度下对健康细胞系COS-7的抑制率仅为0.08%。在K562细胞测试中，5,6-去氢柳杉酚（5, IC508.72 μM）的抑制效果优于阳性对照药依托泊苷（etoposide, IC5014.91 μM）。弯孢霉菌素（13, IC503.36 μM）和霉酚酸（17, IC501.32 μM）的抑制活性也优于依托泊苷。此外，霉酚酸（17, IC500.15 μM）对SK-LU-1细胞表现出最强的细胞毒性，显著优于阳性对照（IC504.90 μM）。PASS对诱导凋亡和抗肿瘤活性的预测结果与实验数据基本吻合。
结论
代谢物在树木不同部位的分布具有特异性：松香烷二萜1-5是墨西哥落羽杉果实中的主要成分，但柳杉酚（4）也从枝条中分离得到。环阿屯烷型三萜7-10则专一性地存在于叶片中，这是该类成分在该物种中的首次报道。本研究共鉴定出17种真菌，以大环内酯类化合物为主要代表性次生代谢产物。PASS预测和病毒抑制实验结果表明，部分分离得到的化合物可能具有抗病毒特性，其中落羽杉二酮（3）在体外实验中显示出最高的SARS-CoV-2 Spike:ACE2复合物形成抑制活性。研究还发现，墨西哥落羽杉及其内生真菌是对特定癌细胞系（如2、5、13、17）具有细胞毒活性的生物活性物质的新来源。这是首次对墨西哥落羽杉的化学成分（包括其部分内生真菌的鉴定与化学成分）进行的综合性报告，为了解其次生代谢产物的产生、生物特性及其相互作用提供了更深入的认识。
实验部分
通用方法：使用硅胶柱色谱、正压色谱、薄层色谱、高效液相色谱等方法分离化合物。通过核磁共振波谱进行结构鉴定。
植物材料：2018年9月采自墨西哥瓜纳华托州。
内生真菌的分离与鉴定：从树皮组织分离可培养真菌，通过ITS rDNA序列分析进行分子鉴定，并构建系统发育树。
化学成分的提取与分离：分别对果实、叶片、枝条的提取物进行系统的色谱分离，从植物材料中分离得到化合物1-12。从指定的内生真菌菌株发酵提取物中分离得到化合物13-20。
活性谱预测：使用PASS在线平台，基于化合物的SMILES代码，预测其抗流感病毒、抗鼻病毒、促凋亡和抗肿瘤的活性概率。
SARS-CoV-2 Spike蛋白:ACE2复合物抑制实验：使用RayBio COVID-19 Spike-ACE2 Binding Assay Kit I检测盒，按照说明书操作，以扎鲁司特（zafirlukast）为阳性对照，测试指定化合物的抑制活性。
细胞毒性评价：采用磺酰罗丹明B法，测试化合物对指定人肿瘤细胞系的生长抑制活性，并计算IC50值。
