《European Journal of Human Genetics》：Accurate and cost-effective workflow integrating trio pooled-WES for novel gene discovery in neurodevelopmental disorders
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本研究针对神经发育障碍（NDD）分子诊断面临的高遗传异质性和传统三重家系全外显子组测序（WES）成本高昂的临床挑战，提出了一种整合“单人WES”与“三重家系样本池化WES”的序贯诊断流程。该研究不仅将诊断率提升至20.98%，还成功识别出13个新的候选基因，并通过验证证实池化策略可在保留传统三重WES优势的同时，显著降低测序成本，为NDD的临床基因诊断提供了一种经济可行的新策略。
神经发育障碍（Neurodevelopmental Disorders, NDDs）是一组影响大脑发育，导致认知、运动和社交功能受损的复杂疾病，具有高度的遗传异质性。据估计，超过1500个基因已被明确证实与NDDs相关，但仍有上千个相关基因未被发现，这使得其精准分子诊断充满挑战。当前，全外显子组测序（Whole-Exome Sequencing, WES）是NDD的一线诊断工具，而结合患者及其父母样本的三重家系WES（trio-WES）能有效识别新发（de novo）变异——这是NDDs最主要的致病机制之一，从而显著提高诊断率和新基因发现效率。然而，三重WES的高昂成本限制了其在临床实践中的广泛应用。如何在保证诊断效能的前提下降低技术成本，成为亟待解决的问题。近期，一种基于混合父母样本DNA进行测序的池化策略（pooled-WES）被提出，它有望保留三重分析的优点并节约成本，但在临床环境中仍未得到充分利用。本研究旨在评估和优化这种池化策略，探索一种兼具高诊断产出和成本效益的新途径，相关成果发表在《European Journal of Human Genetics》期刊上。
为开展此项研究，研究人员建立了一套序贯诊断流程。研究对象来自Fundación Jiménez Díaz大学医院（FJD-UH）的NDD队列，共221名经靶向测序（Targeted Sequencing, TS）未获诊断的综合征性或严重NDD患者。首先对所有患者进行单人WES分析。对于结果阴性或存在多个意义未明变异（VUS）的患者，若有父母DNA样本可用，则进行第二阶段的“三重家系样本池化WES”分析。在池化策略中，将多位父亲和母亲的DNA样本分别等摩尔混合成独立的“父本池”和“母本池”进行测序，而非对每个父母进行单独测序。该方法的核心在于通过优化测序深度和设定变异等位基因频率（VAF）阈值（例如1%），来准确判断在子代中发现的候选变异是否存在于父母池中，从而推断其是否为新发变异。研究还对这一池化策略进行了优化和验证，将其检测灵敏度与标准WES进行了比较。
工作流程结果
共221名患者进入研究流程。其中，153名（69.23%）为畸形或综合征性NDD，43名（19.46%）为孤立性中重度NDD，其余患者伴有其他特征如癫痫、脑畸形等。第一步单人WES在39例（17.65%）中确诊。在剩余的182例未解病例中，79例有父母样本可用，接受了三重池化WES分析。经测试，每个池包含8个样本的配置在数据质量和测序成本间取得了最佳平衡。该流程最终总诊断率为20.81%（46/221），并发现了3个有潜力的拷贝数变异（CNV）和13个位于新候选基因上的意义未明变异。
三重家系样本池化WES策略的优化与验证
研究人员为新发单核苷酸变异（SNV）的检测优化了池化策略，确定了父母池中用于判断变异不存在的VAF阈值。通过对79个三重家系的分析，发现并验证了19个真正的新发SNV。关键的是，所有19个确认的新发SNV在父母DNA池中的VAF均不高于0.58%（1/172 reads），而那些VAF高于1%的SNV均被证实为遗传自父母。因此，研究将1% VAF设定为判断父母池中“不存在”该变异的阈值，用于新发变异的识别。通过对比16名父母的标准WES数据和其在池化WES中的数据，评估了该策略检测超罕见SNV的灵敏度。在1127个超罕见SNV中，有1091个（96.81%）在池中以VAF > 1%被检测到，计算得出的检测灵敏度为96.81%。在包含10个个体的池中，对杂合变异预期的等位基因平衡应为5%，实际观测到的中位VAF为4.74%，与预期值无显著差异。
三重家系样本池化WES的分子发现
对79例三重池化WES的分析，使得7例（8.86%）患者中已知的常染色体显性（AD）NDD基因上的SNV被确认为新发变异，从而被分类为致病或可能致病。更重要的是，该分析在13名患者（16.46%）中发现了位于尚未与NDD关联的基因上的候选SNV：其中11例为常染色体显性或X连锁（XL）基因上经证实的新发杂合SNV；1例为XL基因上的半合子母源性SNV；1例为常染色体隐性（AR）基因上的纯合功能缺失（LoF）SNV。这些候选基因均已提交至GeneMatcher平台等待进一步验证。
总的来说，这项研究成功开发并验证了一种用于NDD诊断的序贯工作流程，它整合了初始的单人WES和后续的三重家系样本池化WES。该策略在221名经预筛选的难解NDD患者中实现了20.98%的总诊断率，并发现了13个新的候选基因，显著推进了新基因的发现。通过优化，研究证实三重池化WES在保持高灵敏度（96.81%）的同时，能将每个三重家系的测序成本降低约56%，使其总成本与“单人WES加Sanger测序验证”方案相当，却保留了完整三重分析在变异解读和遗传模式判定上的全部优势。尽管全基因组测序（WGS）日益普及，但鉴于成本、数据量和分析复杂度，WES目前仍是NDD临床诊断的一线选择。因此，本研究提出的经济高效的三重池化WES策略，对于在当前临床资源限制下提高诊断率、促进新基因发现具有直接的实践意义，为神经发育障碍的精准遗传诊断提供了一条切实可行的新路径。
