《MicrobiologyOpen》：Effects of Lactic Acid Bacteria on Fermentation Quality and Microbiome of Leymus chinensis Silage
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本研究通过为期60天的发酵实验，揭示了植物乳杆菌（LP）和布氏乳杆菌（LB）这两种同型与异型发酵乳酸菌对羊草（Leymus chinensis）青贮发酵特性和微生物群落演替的调控作用。结果表明，与对照组（CON）相比，两种添加剂均能显著（p< 0.05）降低pH和氨氮（NH3–N）含量，并通过塑造以乳杆菌属（Lactobacillus）为主导的菌群结构优化发酵过程。其中，植物乳杆菌在降低pH、提高乳酸（LA）浓度方面表现出更优的效力。本研究为利用特定乳酸菌提升优质青贮饲料的生产提供了科学依据。
引言
社会经济的发展加剧了饲草供应与畜牧需求之间的不平衡。作为一种禾本科多年生牧草，羊草（Leymus chinensis）因其适口性好，是反刍动物的重要饲料资源。然而，仅靠放牧和调制干草通常难以保证全年为反刍动物持续提供高质量的羊草。青贮作为一种公认的有效保存牧草营养的方法，其原理是通过乳酸菌（LAB）介导的厌氧发酵降低pH，从而抑制霉菌和腐败菌。然而，青贮饲料的发酵品质常受到新鲜牧草固有化学成分及其附生微生物群落的限制。羊草青贮发酵品质不佳，常表现为pH值偏高、乳酸（LA）浓度不足，这通常归因于新鲜牧草上附生乳酸菌丰度较低。为此，人们开发了多种乳酸菌添加剂以改善发酵品质和保存效率。
先前的研究根据发酵终产物的不同，将乳酸菌添加剂分为同型发酵和异型发酵两种类型。同型乳酸菌可通过糖酵解途径、磷酸戊酮糖途径和戊糖磷酸途径降解葡萄糖、戊糖和木糖，而异型乳酸菌则通过戊糖磷酸途径降解葡萄糖、戊糖和木糖，产生不同的终产物。以植物乳杆菌、戊糖乳杆菌和布氏乳杆菌为代表的同型和异型发酵乳酸菌菌株，被广泛用于快速降低pH、抑制有害微生物、提高有氧稳定性及保存营养成分。然而，尽管全球研究已广泛探讨了乳酸菌添加剂对苜蓿、玉米、大麦和小麦等作物细菌群落的影响，但关于整个发酵期间经乳酸菌处理的羊草其细菌群落动态的信息仍然匮乏。
基于对同型、异型发酵乳酸菌特性及羊草青贮的现有认识，本研究假设羊草青贮的动态变化与发酵过程中微生物群落结构的纵向改变相关。因此，本研究利用16S rRNA扩增子测序技术，调查了不添加或添加乳酸菌制备的羊草青贮的发酵特性及微生物群落演替。
材料与方法
本研究使用的羊草于2023年9月3日（抽穗期）在中国呼和浩特采样获得。新鲜羊草的干物质（DM）含量为54.33%，其化学成分详见表1。原料经手动铡草机切至约2厘米段后，分为三个处理组：分别用蒸馏水（对照，CON）、布氏乳杆菌（LB，异型发酵乳酸菌）和植物乳杆菌（LP，同型发酵乳酸菌）处理。两种添加剂均以1 × 106cfu/g鲜重的浓度添加。每个重复取300克切碎并经处理或未处理的羊草，真空密封于聚乙烯袋中，置于室温（22°C–25°C）下。
在发酵第3、7、14、30和60天进行采样，以评估发酵品质和微生物动态。干物质测定采用65°C烘箱干燥72小时。营养评价中，粗蛋白（CP）含量依据AOAC标准程序测定；中性洗涤纤维（NDF）和酸性洗涤纤维（ADF）浓度依据范氏法测定；水溶性碳水化合物（WSC）浓度通过蒽酮-硫酸比色法测定。
取10克切碎的新鲜或青贮羊草样品，与90毫升去离子水均质，过滤后，用便携式pH计测定滤液pH值。有机酸（乳酸LA、乙酸AA、丙酸PA、丁酸BA）含量通过高效液相色谱法（HPLC）测定。氨氮（NH3-N）含量依据苯酚-次氯酸盐法测定。
采用CTAB法提取新鲜及青贮羊草的基因组DNA。利用Illumina NovaSeq. 6000平台对16S rRNA基因的V3–V4高变区进行高通量测序。原始序列数据经Qiime2流程处理，使用DADA2插件过滤低质量读长并生成扩增子序列变体（ASVs）。基于SILVA数据库对ASVs进行物种注释。通过Bray–Curtis相异矩阵进行主坐标分析（PCoA），并使用PERMANOVA验证组间差异。通过LEfSe分析识别不同处理和时间下的差异标志性物种，并通过Mantel检验分析微生物群落与发酵参数的相关性。
使用SAS 9.0软件通过一般线性模型（GLM）评估乳酸菌添加剂和发酵时长对结果的影响，统计显著性设定为p< 0.05。
结果
1. 发酵前羊草的特性
如表1所示，羊草的WSC、CP、ADF和NDF含量分别为DM的4.95%、8.21%、38.70%和64.29%。羊草含有较低的有益乳酸菌（3.79 log cfu/g鲜重）和较高的肠杆菌（6.73 log cfu/g鲜重）。
2. 羊草青贮的发酵品质
如表2所示，处理组和发酵时间均显著改变了羊草青贮的发酵属性。所有化学指标均存在添加剂与青贮时长的显著交互作用。随着发酵进行，所有组的pH值均下降，但CON组pH始终高于添加组，其中LP组最终pH最低。这种酸化是由有机酸，特别是LA和AA的持续积累驱动的。至第60天，LP和LB组分别表现出最高的LA和AA浓度。PA含量同样在60天内增加，在LB组达到峰值，而BA在所有样品中均未检出。与有机酸趋势一致，NH3-N水平随青贮进程而升高，实验结束时CON组的浓度最高。
3. 羊草青贮的细菌群落参数
通过对33个样品（包括原料和青贮样品）的16S rRNA基因谱分析，共获得1,831,365条优化读长。如表3所示，单个样品的测序深度在40,249到76,256之间。如图1A、B所示，微生物α多样性在整个发酵期间显著降低，LP组表现出最显著的细菌复杂性下降。β多样性分析（PCoA）显示各处理组间微生物群落存在明显分化，解释了71.31%的微生物变异。PERMANOVA结果进一步证实了发酵过程中细菌种群的时间演替。
在原料羊草中，核心菌门为变形菌门、厚壁菌门和放线菌门，总丰度超过97%。在属水平上，主要细菌为乳杆菌属、鞘氨醇单胞菌属、甲基杆菌-甲基红细菌属和未分类的微杆菌科。然而，经过60天青贮后，细菌组成从原料中的变形菌门、厚壁菌门和放线菌门转变为以厚壁菌门为主。羊草青贮的细菌群落在整个发酵过程中呈现一致的演替模式。至第60天，乳杆菌属相对丰度急剧增加，同时鞘氨醇单胞菌属和甲基杆菌-甲基红细菌属丰度下降。值得注意的是，从第3天到第60天，乳杆菌属在微生物群落中占据主导地位，尤其在LB和LP处理中。LEfSe分析显示，原料中含有最多的差异标志物。青贮第3天，LB和LP组中肠杆菌目和γ-变形菌纲等不良类群被显著抑制。在不同发酵时间点的LEfSe分析进一步显示，发酵3天时，CON组富集了红球菌属、微杆菌属、肠球菌属和明串珠菌属；发酵7天和14天时，CON组富集了魏斯氏菌属和肠球菌属，而乳杆菌属在LB和LP组富集；发酵30天和60天时，乳杆菌属同样在LB和LP组富集。
4. 微生物群落与发酵特性的相关性
Mantel检验用于评估羊草青贮发酵特性与微生物群落结构之间的关联。如图3所示，乳杆菌属与所有发酵品质参数均显著相关，包括pH、LA、PA和AA。包括肠球菌属、甲基杆菌-甲基红细菌属、微杆菌属和诺卡氏菌属在内的几个细菌属，与pH和LA也显示出显著相关性。
讨论
青贮在保存牧草营养成分、延长反刍动物饲料可用期方面具有不可否认的作用。本研究中，所有处理组在60天发酵期后最终pH均低于4.70，表明羊草青贮保存成功。与CON组相比，微生物添加剂的应用显著改变了整个发酵期间LA、AA和PA的积累。LP和LB处理分别产生了更高水平的LA和AA，表明添加剂改善了发酵。LA和AA浓度的显著差异可归因于植物乳杆菌和布氏乳杆菌所利用的不同代谢途径。丁酸浓度与有害微生物相关，本研究中其含量低于检测水平，表明酸性环境抑制了有害微生物。CON组较高的NH3-N含量表明青贮过程中发生了蛋白质降解，这可能与CON组肠杆菌科丰度较高有关，后者可通过脱羧和脱氨作用分解氨基酸。
通过16S rRNA测序跟踪了羊草青贮过程中细菌群落的变化。与新鲜羊草相比，所有处理组的微生物多样性和丰富度均一致下降，表明青贮条件对微生物群落有抑制作用。LB和LP组多样性和丰富度的下降可能源于接种乳酸菌的快速主导及其对竞争微生物的抑制。PCoA显示原料与三个处理组之间存在明显的聚类分离，但随发酵延长未见清晰分化，表明青贮过程显著改变了细菌群落结构。值得注意的是，优势菌门从原料中的变形菌门转变为所有处理组中的厚壁菌门，这与厚壁菌门更适应厌氧和酸性条件的先前发现一致。在青贮早期，乳杆菌属即成为所有组的优势属，并随着pH下降、其耐酸性使其丰度持续增加。
发酵品质由青贮微生物群驱动的生化过程所控制。网络分析是表征特定节点与变量之间相互作用的流行方法。分析微生物群落与青贮性能之间的关系有助于我们更好理解关键细菌在改善青贮性能中的作用。乳杆菌属与所有发酵品质参数均显著相关，导致羊草青贮中有机酸水平升高和pH值降低。肠球菌属与pH值呈正相关，这可能与该属仅在pH > 4.5的环境中生长有关。诺卡氏菌属因其复杂的细胞脂肪酸谱，被广泛应用于抗生素合成和污染物生物修复，可能导致LA浓度增加。
结论
综上所述，本研究阐明了布氏乳杆菌或植物乳杆菌对羊草青贮的影响。结果表明，两种乳酸菌菌株均能改善发酵性能；然而，植物乳杆菌在降低pH和NH3-N水平、提高LA浓度方面表现出更优的效力。羊草青贮的发酵品质主要由乳杆菌属主导，这为乳酸菌在羊草青贮保存中的重要性提供了证据。本研究揭示了乳酸菌添加剂对羊草青贮的调控作用，为利用特定乳酸菌生产优质青贮饲料提供了支持。
