《Applied Microbiology and Biotechnology》：Effects of sialylated oligosaccharides on the N- and O-glycosylation of etanercept in recombinant CHO cells
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本研究针对重组CHO(rCHO)细胞生产治疗性糖蛋白过程中糖基化（特别是唾液酸化）控制的关键问题，研究人员通过评估多种酶法合成唾液酸化寡糖对Fc融合蛋白依那西普糖基化谱的影响，发现唾液酸化寡糖（如DSLNnT）可有效提升细胞内CMP-SA水平，从而显著增加依那西普的二唾液酸化N-糖和O-糖比例及总唾液酸含量，为优化rCHO细胞培养工艺、提高治疗性糖蛋白质量提供了新型补充策略。
在现代生物制药领域，重组中国仓鼠卵巢（CHO）细胞是生产治疗性糖蛋白的主力军，它们能够完成复杂的人源化翻译后修饰。然而，这些“细胞工厂”的生产过程并非完美无缺，一个关键的挑战在于如何精准控制糖蛋白的“糖衣”——即糖基化修饰，特别是被称为“糖链终结者”的唾液酸化。唾液酸是糖链末端的“帽子”，其数量和结构直接影响糖蛋白在体内的“存活时间”（血清半衰期）和药效。遗憾的是，在CHO细胞大规模培养中，诸如高渗、氨积累、细胞死亡释放唾液酸酶等多种因素，常导致目标蛋白唾液酸化水平不足，这不仅降低了药物的治疗效果，也增加了生产工艺的不稳定性，是生物药质量控制的一大痛点。
为此，科研人员一直在寻找能“喂”给细胞、有效提升唾液酸化的“营养补充剂”。传统的策略是添加N-乙酰甘露糖胺（ManNAc）等核苷酸糖前体，但考虑到CHO细胞克隆间的差异，开发更多样、更有效的替代物至关重要。唾液化乳糖等唾液酸化寡糖，作为人乳中天然存在的成分，近年来进入了研究者的视野。本研究团队便将目光投向了多种酶法合成的唾液酸化寡糖，探究它们能否作为一种新型“外援”，有效提升在重组CHO（rCHO）细胞中生产的明星药物——依那西普（一种用于治疗类风湿关节炎等的Fc融合蛋白）的唾液酸化水平，并深入探索其背后的作用机制。
本研究发表在国际期刊《Applied Microbiology and Biotechnology》上。研究人员主要运用了以下几项关键技术方法：1. 建立了两种稳定表达依那西普、具有不同基础唾液酸化水平的rCHO细胞株（CHO-ETN-L和CHO-ETN-H克隆），用于细胞培养和糖蛋白生产。2. 在细胞培养过程中，分别添加了7种酶法合成的寡糖（3′-唾液化乳糖、6′-唾液化乳糖、唾液化乳糖-N-四糖a、二唾液化乳糖-N-新四糖、乳糖-N-四糖、乳糖-N-新四糖及乳糖）进行干预。3. 通过等电聚焦（IEF）凝胶分析蛋白质酸性异构体分布，利用亲水作用色谱-超高效液相色谱（HILIC-UHPLC）技术解析N-糖和O-糖的精细结构。4. 采用离子对反相高效液相色谱定量分析细胞内的关键核苷酸糖CMP-唾液酸（CMP-SA）的浓度，以探究其与唾液酸化增强的关联。
研究结果
Effects of sialylated oligosaccharides on cell growth and etanercept production（唾液酸化寡糖对细胞生长和依那西普生产的影响）
通过分析细胞生长、活力和依那西普产量曲线，研究人员发现，无论是否添加任何寡糖，两种rCHO细胞的生长、代谢和蛋白产量均未受到显著影响。这表明，在所用浓度下，这些酶法合成的寡糖对细胞本身是安全的，其后续效应并非通过改变基本细胞生理实现。
Effects of sialylated oligosaccharides on the isoform distribution of etanercept（唾液酸化寡糖对依那西普异构体分布的影响）
对纯化的依那西普进行等电聚焦凝胶分析发现，只有在添加了含有唾液酸残基的四种寡糖（3′-SL, 6′-SL, LSTa, DSLNnT）的培养物中，依那西普的酸性异构体（位于pH 5.3/5.2以下）比例才显著增加。而添加不含唾液酸的寡糖（乳糖、LNT, LNnT）则无此效果。这直接证明，增强唾液酸化的效应特异性地来源于补充的寡糖中所携带的唾液酸。
Effects of sialylated oligosaccharides on the N-glycan profiles of etanercept（唾液酸化寡糖对依那西普N-糖谱的影响）
对N-糖的精细结构分析显示，唾液酸化寡糖的补充显著改变了糖型分布。具体表现为，非唾液酸化（G2）和单唾液酸化（G1S1F）糖型的比例下降，而二唾液酸化糖型（G2S2和G2S2F）的比例则大幅上升。在两种细胞系中，添加DSLNnT等唾液酸化寡糖后，二唾液酸化N-糖占总N-糖的比例最高可提升至2.2倍，表明不完整的糖链被“补全”为完全唾液酸化的成熟形式。
Effects of sialylated oligosaccharides on the O-glycan profiles of etanercept（唾液酸化寡糖对依那西普O-糖谱的影响）
与主要由单唾液酸化形式组成的对照相比，某些唾液酸化寡糖（如LSTa和DSLNnT）能显著提升O-糖中二唾液酸化形式的比例。例如，在CHO-ETN-L克隆中，LSTa使二唾液酸化O-糖比例提升了9.7倍。这证实了唾液酸化寡糖对O-糖的唾液酸化同样具有调节潜力。
Effects of sialylated oligosaccharides on the sialic acid content of etanercept（唾液酸化寡糖对依那西普唾液酸含量的影响）
总唾液酸含量分析表明，只有添加了唾液酸化寡糖，才能增加依那西普中N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac，人体主要的唾液酸形式）的含量，而对非人源的N-羟乙酰神经氨酸（Neu5Gc）含量无影响。这进一步从总量上证实了唾液酸化水平的提升，且该提升是朝着更符合人体需求的方向发展。
Effects of sialylated oligosaccharides on the intracellular CMP-SA concentration（唾液酸化寡糖对细胞内CMP-SA浓度的影响）
机制探究发现，唾液酸化水平的提升与细胞内CMP-SA浓度的急剧升高密切相关。只有含唾液酸的寡糖才能大幅提升CMP-SA水平，且提升幅度与寡糖分子上携带的唾液酸残基数量正相关。含有两个唾液酸的DSLNnT引起的CMP-SA升高最为显著，在CHO-ETN-L克隆中可达45.8倍。这表明，补充的唾液酸化寡糖很可能作为直接前体，被细胞代谢用于合成CMP-SA，从而为糖蛋白的唾液酸化提供了充足的“原料”。
Validation of the effectiveness of sialylated oligosaccharides in HEK293 cells（在HEK293细胞中验证唾液酸化寡糖的有效性）
为了探究该策略的普适性，研究在表达依那西普的人胚胎肾（HEK293）细胞中进行了验证。有趣的是，四种唾液酸化寡糖均未能显著提升HEK293细胞所产依那西普的唾液酸化水平，对细胞内CMP-SA浓度的提升也微乎其微。进一步分析发现，HEK293细胞本底的CMP-SA浓度就远高于两种rCHO细胞。这意味着，HEK293细胞自身的唾液酸合成通路可能已足够活跃，无需额外“补充”，也提示了该策略对细胞内CMP-SA水平相对较低的rCHO细胞系更具应用价值。
归纳与讨论
本研究系统性地证实，酶法合成的唾液酸化寡糖，特别是二唾液化乳糖-N-新四糖（DSLNnT），能够作为一种高效的新型培养补充剂，特异性提升由重组CHO细胞生产的Fc融合蛋白依那西普的唾液酸化水平。其核心作用机制在于，这些寡糖上的唾液酸残基进入细胞后，显著增加了细胞内关键供体底物CMP-唾液酸（CMP-SA）的库容，从而驱动了更多不完全的N-糖和O-糖链被“加帽”，形成完全唾液酸化的终末结构。
这项研究具有多重重要意义。首先，在应用层面，它为解决rCHO细胞培养中治疗性糖蛋白（尤其是像依那西普这类高度依赖唾液酸化以延长半衰期的Fc融合蛋白）唾液酸化不足的行业难题，提供了一类有前景的新策略。与传统的ManNAc相比，唾液酸化寡糖提供了更多样化的候选分子，有助于针对不同细胞克隆的特性进行优化。其次，在机制层面，研究明确了CMP-SA水平提升是效应产生的关键中间环节，并将效应与补充寡糖的唾液酸残基数量相关联，深化了对该过程的理解。最后，在认知层面，研究发现该策略对HEK293细胞无效，并揭示其基础CMP-SA水平本已很高，这凸显了宿主细胞系代谢背景对糖基化工程策略有效性的决定性影响，提示未来的工艺优化需要“因细胞制宜”。
综上所述，这项研究不仅拓展了用于糖基化调控的培养补充剂“工具箱”，也为在分子水平上理解和操控重组蛋白的糖链结构提供了新的见解，对提升生物制药的产品质量和工艺稳健性具有重要的科学价值与应用潜力。
