基于传热模型优化酿酒酵母近缘野生种Saccharomyces eubayanus的低温保存策略

《Applied Microbiology and Biotechnology》：Optimizing cryopreservation protocols of Saccharomyces eubayanus using heat transfer modeling

为了优化对工业级重要耐冷野生酵母Saccharomyces eubayanus的低温保存策略，提升其在长期保存后的活力，研究人员结合有限元法（FEM）数值模拟与实验验证，对两种冷冻方案（直接置于-80°C冻存盒与通过CoolCell?装置冻存）的传热特性（整体传热系数U）及细胞存活率进行了系统性评估。研究发现，直接置于冻存盒的方案（PROTOCOL A）因其更高的U值（18.04 W m-2K-1）和更优的冷却速率（5–7 °C min-1），在冻存一年后实现了更高的细胞存活率（71.7%），显著优于CoolCell?方案（PROTOCOL B，51.2%）。该研究为酵母低温保存提供了更为简单、高效且低成本的标准化方案，并证明了整体传热系数是评估低温保存性能的关键工程参数。

　　

在精酿啤酒的世界里，有一种特殊的、耐低温的酵母“明星”——Saccharomyces eubayanus。它不仅是拉格啤酒（lager）生产酵母Saccharomyces pastorianus的“冷适应”亲本，更在发酵工业中扮演着至关重要的角色。然而，如何长期、有效地保存这些珍贵的微生物“火种”，是众多研究和工业实验室面临的共同难题。传统的低温保存方法，比如使用CoolCell?或Mr. Frosty?这类专用控速冻存盒，虽然能提供标准的1 °C/min冷却速率，但流程繁琐、耗时长、成本高，且需要借助干冰等辅助工具来转移样品，存在样品意外升温的风险。更关键的是，这个“金标准”冷却速率真的适用于所有细胞类型吗？对于像S. eubayanus这样具有不同生物物理特性的酵母来说，或许存在更优的降温方案。为了破解这个难题，一组研究人员决定从工程学角度，用“热量”的语言来解读“冷冻”的秘密，探究哪种方法能更好地保护这些工业酵母的活力。

为了回答上述问题，研究人员主要应用了以下几个关键技术方法：1. 设计了两种对比性低温保存方案（PROTOCOL A: 将装有酵母/甘油混合物的冻存管直接放入-80°C冻存盒；PROTOCOL B: 将冻存管放入CoolCell?装置后再置于-80°C冰箱），并使用热电偶和数采仪对冻存管内部（中心和管壁）的温度-时间曲线进行实时监测，以获取冷却速率和特征冷冻时间（tc）。2. 利用COMSOL Multiphysics有限元分析软件，建立了包含冻存管、细胞悬液和气相空间的多域、轴对称几何模型，并输入水和甘油-水混合物（10% w/w）随温度变化的热物理性质（导热系数、密度、表观比热），数值求解了带有相变的瞬态热传导方程，以模拟整个冷冻过程。3. 通过对比纯水冻存的实验温度曲线与不同整体传热系数（U）下的模拟曲线，利用残差平方和最小法，精确拟合出两种方案对应的U值（UA和UB），并将此U值代入含酵母的模型进行验证。4. 在-80°C冻存一年后，采用25°C水浴快速复温，通过平板菌落计数法评估细胞存活率（Viability），并通过测量菌落直径评估细胞活力（Vitality）。

1. 实验冷冻温度-时间曲线

研究人员测量了两种方案下冻存管中心的温度随时间的变化。结果显示，无论是对于纯水还是酵母-甘油混合液，PROTOCOL A（直接冻存）达到-80°C所需的时间远短于PROTOCOL B（CoolCell?冻存）。前者的特征冷冻时间tc约为10.9分钟，而后者长达27.6分钟，表明PROTOCOL A的降温速度更快。在相变平台区，纯水在0°C，而10%甘油-水混合液的初始冻结温度T_f约为-2.38°C。冷却速率被分为三个阶段计算：V1（初始降温）、V2（相变区）、V3（完全冻结后降温）。

2. 低温保存过程的数学模型

研究人员建立了柱坐标系下的热传导方程，以描述冻存管内液体（Ω_f）、塑料管壁（Ω_p）和顶端气相（Ω_a）的传热过程。方程考虑了相变导致的材料物性剧变，并通过引入Heaviside和Gaussian函数对表观比热进行平滑处理，确保了有限元计算的稳定性。模型中关键的外部边界条件由整体传热系数U定义，它反映了冻存管与环境（冷空气或CoolCell?塑料材料）之间的热交换效率。

3. 确定纯水冻存管的整体表面传热系数

通过对比纯水冻存的实验数据与不同U值下的模拟曲线，研究人员确定了能使残差平方和最小的U值。最终得到的平均值为：PROTOCOL A的UA = 18.7 W/m²K，PROTOCOL B的UB = 4.7 W/m²K。UA值远大于UB，证实了空气对流（PROTOCOL A）的传热效率远高于通过绝缘塑料的传导（PROTOCOL B）。2 K) and b PROTOCOL B (Ti = 21.6 °C, UB = 3.8 W/m²K)">

4. 数学模型的验证

将上述确定的UA和UB值作为输入，代入包含酵母-甘油混合液物性的模型中进行模拟。模拟得到的温度-时间曲线与实验数据高度吻合，从而验证了所建数学模型和所获U值的准确性。这表明，通过纯水实验标定U值，再用于预测复杂生物悬浮液冷冻过程的方法是可靠的。2 K) and b PROTOCOL B (Ti = 23 °C, UB = 4.6 W/m²K)">

5. 冷却与复温速率、存活率与活力

对冷冻速率的详细分析表明，PROTOCOL A在酵母-甘油混合液中的初始冷却速率V1平均为6.75 °C/min，完全冻结后的速率V3为6.86 °C/min，均显著高于PROTOCOL B。复温过程在25°C水浴中进行，速率高达约105 °C/min，有助于避免复温过程中冰晶再生长造成的损伤。最关键的结果来自细胞存活率：冻存一年后，PROTOCOL A的细胞存活率达到71.7% ± 3.5%，显著高于PROTOCOL B的51.2% ± 3.6%。然而，两种方案的细胞活力（以菌落直径为指标）均比未冻存的对照组下降了约30%，表明尽管存活细胞能增殖，但其代谢恢复可能受到了亚致死损伤的影响。

6. 讨论

本研究的结论挑战了“1 °C/min是适用于所有真核细胞的最佳冷却速率”这一普遍假设。该速率对于人类哺乳动物细胞（如淋巴细胞、干细胞）至关重要，因为这些细胞需要精细平衡以避免细胞内冰晶形成和溶液效应损伤。然而，酵母细胞具有更高的水渗透性和表面积体积比，使其在更快的冷却速率下（3-10 °C/min）仍能有效脱水达到渗透平衡。PROTOCOL B的1 °C/min速率对于S. eubayanus而言过慢，导致细胞长时间暴露于高浓度溶质的“溶液效应”中，造成损伤。而PROTOCOL A提供的5-7 °C/min速率更接近酵母的最佳范围，在避免细胞内结冰的同时，最大限度地减少了溶液损伤。

计算得到的毕渥数（Biot number）均远小于1，表明在两种方案下，冻存管内部的温度分布都高度均匀，细胞经历的热历程一致，这强化了由外部传热系数U主导冷冻过程的结论。因此，整体传热系数U成为一个评估和比较不同低温保存方案性能的关键工程参数。

从实际应用角度看，PROTOCOL A（直接冻存于冻存盒）不仅获得了更高的细胞存活率，而且操作更简单、成本更低廉（无需专用冻存盒和干冰）、耗时更短，避免了样品转移过程中的升温风险，为工业规模和文化保藏中心的酵母标准化低温保存提供了极具吸引力的替代方案。

综上所述，这项发表于《Applied Microbiology and Biotechnology》的研究，通过创新性地融合实验生物学与计算传热学，不仅为S. eubayanus找到了一种更优的低温保存方法，更重要的是提供了一个普适性的研究框架。它阐明了对特定生物体系，应根据其生物物理特性寻找“个性化”的最佳冷冻方案，而非盲目遵循通用标准。该研究将整体传热系数确立为连接工程参数与生物学结果的核心桥梁，为未来优化其他微生物乃至更复杂生物系统的低温保存策略，提供了坚实的理论和实践基础。