《Cancer Discovery》：A, Hierarchical clustering analysis of the 1,000 protein-coding genes with...
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本期推荐一篇揭示终末期肾病（ESRD）背景下获得性囊性肾病（ACKD）及肾癌发生机制的重要研究。研究者通过对43名患者的268个样本进行多组学空间分析，发现ESRD相关肾癌的分子图谱与散发性肾细胞癌（RCC）不同，并首次揭示了ACKD的囊肿源于炎症环境中存活的近端肾小管（PT）细胞的克隆性扩增，而周围微环境通过旁分泌激活MET酪氨酸激酶通路促进囊肿发展。本研究为理解ESRD患者的肿瘤发生机制及改善预后提供了新的见解。
研究方案与患者队列
本研究旨在阐明长期透析条件下肾脏囊肿和肿瘤形成的分子机制。研究共纳入43名接受血液透析（HD）并在东京大学医院和三井纪念医院接受根治性肾切除术的患者。在54个肿瘤中，主要组织学亚型为获得性囊性肾病相关肾细胞癌（ACD-RCC，占46.3%）和ESRD-透明细胞肾细胞癌（ESRD-ccRCC，占30%）。与ESRD-ccRCC患者相比，ACD-RCC患者的中位HD持续时间更长（170个月 vs. 41个月）。研究对肿瘤样本进行了外显子组测序（exome-seq）和RNA测序（RNA-seq），并对非癌性肾皮质进行了RNA-seq。为了深入解析ESRD肾脏的微环境，还进行了基于液滴的3‘端单细胞RNA测序（scRNA-seq）和空间转录组学（10x Genomics Visium和Xenium平台）分析。此外，通过激光捕获显微切割（LCM）对来自ESRD患者的肾囊肿和肿瘤进行了外显子组测序。
ESRD患者肾肿瘤的基因组学特征
研究人员首先描绘了ACD-RCC和ESRD-ccRCC的体细胞突变图谱。与散发性ccRCC不同，在ACD-RCC中未检测到显著的驱动基因突变，且未观察到VHL基因突变。然而，每个样本都含有影响染色质调节因子通路相关的癌症相关突变。有趣的是，在33%的ESRD-ccRCC病例中发现了TCEB1基因的 recurrent 突变，该频率高于日本ccRCC队列和癌症基因组图谱（TCGA）队列。拷贝数变异分析显示，散发性ccRCC中特征性的3p缺失在ESRD-ccRCC中仅出现在33%的病例中，且与VHL突变病例相对应。在ACD-RCC样本中，除了之前报道的5、7、12和16号染色体增加外，还发现了3号和8号染色体的 recurrent 增加，其中16号染色体增加出现在62%的病例中，提示这可能是ACD-RCC的早期遗传改变。
ESRD中的多原发性肿瘤
ESRD相关癌症的特征之一是每位患者存在多个肿瘤。本研究中有9名患者出现了共计26个同步或异时性肿瘤，其中ACD-RCC是主要的病理亚型（61.5%）。突变图谱显示，即使在同一患者体内，同步和异时性肿瘤之间也不共享任何突变，表明这些肿瘤是独立发生的，而非转移所致，这进一步凸显了ACKD的易癌变特性。
ESRD患者肾肿瘤的转录组学特征
通过比较ACD-RCC、ESRD-ccRCC、散发性ccRCC以及非透析患者非癌性肾皮质的批量RNA-seq数据，发现不同病理亚型的表达模式明显区分。与正常肾脏相比，ACD-RCC的特征是MYC靶标和糖酵解通路基因集的富集。与散发性ccRCC相比，ACD-RCC中高表达的基因富集于代谢过程通路，特别是AMACR等基因显著激活。值得注意的是，与近端肾小管（PT）相关的基因（如LRP2、GATM）在ACD-RCC中高表达。单细胞RNA测序和空间转录组学（Visium）分析进一步证实了AMACR和LRP2等ACD-RCC特征基因在肿瘤细胞中的特异性高表达。
透析患者肾脏的炎症微环境
对透析患者和非透析患者非癌性肾皮质的分析发现，透析肾脏的转录组发生了变化。基因集富集分析显示，透析肾皮质中上皮-间质转化（EMT）和炎症信号通路（如TNF信号）相关基因集被激活。与正常肾脏相比，透析肾脏中成纤维细胞和免疫细胞浸润相关基因表达上调，且病理切片证实了淋巴细胞浸润。同时，PT相关基因的表达水平在肾功能受损/透析肾皮质中降低，反映了慢性肾脏病（CKD）中的PT细胞损伤。单细胞RNA测序分析显示，与非透析肾脏相比，透析肾脏中成纤维细胞比例显著增加，而内皮细胞和足细胞比例减少。对成纤维细胞亚型的进一步分析发现，随着肾功能下降，MYH11+和COL15A1+成纤维细胞增加，而CD74+和POSTN+成纤维细胞减少。
透析肾脏的免疫细胞图谱
多重免疫组化分析显示，与正常肾脏相比，透析肾脏和ACD-RCC样本中的总免疫细胞（包括NK细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞和巨噬细胞）密度显著更高。特别是，ACD-RCC肾脏中巨噬细胞密度显著增加，其中M1样巨噬细胞增多。单细胞RNA测序将巨噬细胞分为8个亚群，其分布因肾脏状况而异。与非透析肾脏相比，透析肾脏中ISG15+和C1QC+巨噬细胞富集。SPP1+巨噬细胞在肿瘤组织中更丰富，该亚群已知具有促肿瘤功能。细胞间通讯网络分析揭示了成纤维细胞（受体）与巨噬细胞（配体）之间通过IL1b/IL受体、PDGFB/PDGFRB、VEGFA/NRP1以及TGF-β家族配体/TGFBR2/3受体等多种途径存在相互作用。
空间转录组揭示肾囊肿组织起源于近端肾小管
通过空间转录组学分析，在透析患者的肾脏中识别出了对应于肾囊肿的独立细胞簇。PT基因在该囊肿簇中高表达，而远端小管和集合管基因不表达。值得注意的是，在许多透析患者的肾皮质中，囊肿壁外的PT基因表达极少甚至没有，这与病理上观察到的PT萎缩或缺失一致。除了囊肿壁，PT基因在囊肿内发生的早期ACD-RCC肿瘤中也高表达。单细胞分辨率空间分析进一步证实，NAT8和GATM等PT基因在囊肿壁细胞和ACD-RCC肿瘤区域中大量表达。这些结果表明，ESRD患者的囊肿和ACD-RCC肿瘤都可能起源于PT细胞。
近端肾小管细胞形成囊肿的机制
整合透析和非透析患者肾皮质的单细胞RNA测序数据，对PT基因阳性细胞进行亚群分析，发现来自透析肾脏的细胞可分为三个主要簇：一个高表达PT基因（对应肾囊肿），一个缺乏PT基因表达（对应萎缩的PT细胞，称为终末PT细胞）。拟时序分析显示，在ESRD条件下，正常的PT细胞大部分转化为终末PT细胞，但一小部分细胞分化形成囊肿细胞。囊肿特异性基因包括AMACR、LDHB等在囊肿簇中上调，而终末PT细胞中则富集S100A9、PROM1等与肾损伤相关的基因。这些结果提示囊肿和终末PT细胞可能经历了不同的损伤模式，影响了它们各自的命运。
ACKD中近端肾小管细胞的克隆性扩增
通过单细胞RNA测序数据推断拷贝数变异，在ACD-RCC肿瘤中发现了5、7、12和16号染色体的扩增，这与批量外显子组数据一致。有趣的是，在透析患者非癌性肾皮质的囊肿簇中也发现了相似的拷贝数变化，提示这些变化在囊肿阶段就已存在。通过激光捕获显微切割对非癌性囊肿壁进行外显子组测序，发现了高变异等位基因频率的基因突变。例如，在一个ACD-RCC患者的肿瘤中检测到SMC1A突变，同一突变在周围囊肿区域也以高频率被检测到。在另一个ACKD患者的囊肿中，发现了STAG3和MAP2K1基因的高频突变。对囊肿样本的外显子组分析在所有被检囊肿中都检测到了克隆性扩增，癌症相关基因突变频繁出现，其中染色质调节因子和黏连蛋白复合体基因的突变分别占29%和23%。系统发育树分析揭示了肿瘤与周围囊肿之间紧密的克隆关系，以及囊肿结构内复杂的克隆结构。这些数据共同支持ACKD囊肿是由携带体细胞突变的PT细胞寡克隆扩增形成的。然而，由于这些突变在ACD-RCC肿瘤中并不常见，染色质调节因子和黏连蛋白复合体基因的突变可能在ACKD炎症环境的适应过程中被优先选择。
促进囊肿形成的微环境
为探寻支持囊肿克隆扩增的微环境，研究者通过算法分析了囊肿与微环境细胞之间可能的配体-受体相互作用。发现囊肿与巨噬细胞之间可能存在通过IL1β/IL受体或VEGFA/NRP1的相互作用，囊肿与T细胞之间可能存在通过TGF-β家族配体/TGFBR2/3的相互作用。有趣的是，囊肿细胞中表达最高的受体酪氨酸激酶之一是MET，而其配体HGF则在成纤维细胞和内皮细胞中表达。在囊肿与成纤维细胞的相互作用中，HGF主要由COL15A1+成纤维细胞簇分泌，该簇在透析肾脏中增加。在囊肿与巨噬细胞的相互作用中，IL1b和VEGFA由巨噬细胞中的IL1B+和VEGFA+亚群分泌。单细胞空间分析显示囊肿与勾勒囊肿结构的成纤维细胞紧密相邻，且这些囊肿细胞表达MET。免疫组化进一步证实，囊肿和ACD-RCC样本中均存在MET及其磷酸化形式的表达，且在囊肿的连续切片中，磷酸化MET与HGF的染色区域相邻。这些发现表明，囊肿可能受到众多微环境细胞通过配体-受体相互作用的滋养，特别是HGF-MET通路，在囊肿的发展和维持中可能起到关键作用。
