靶向PI3Kβ酪氨酸磷酸化：PTEN缺失肿瘤的新治疗策略与生物标志物发现

《Cancer Discovery》：Phosphorylation of PI3Kβ is critical for PTEN-null tumor formation and grow... Open Access

本研究揭示了PTEN缺失肿瘤中的全新致癌机制，提出了PI3Kβ第962位酪氨酸磷酸化(p-PI3KβY962)作为关键靶点。PTEN作为蛋白酪氨酸磷酸酶，失活导致p-PI3KβY962上调，促进其与EPHA2形成致癌复合体，激活pERK/c-MYC和pAKT通路。该工作开发了特异性p-PI3KβY962抗体，证明其是PTEN缺失的有效生物标志物，并发现达沙替尼(dasatinib)可靶向此信号轴，为PTEN缺陷实体瘤的精准治疗开辟了新方向。

　　

BioID蛋白质互作谱分析揭示PI3Kβ–EPHA2相互作用在PTEN缺失的癌细胞中被诱导

为了探究PTEN缺失背景下PI3Kα和/或PI3Kβ是否形成新的互作网络，研究团队在PTEN缺陷的乳腺癌细胞系(BT549和MDA-MB-468)中进行了针对这两种亚型的BioID邻近标记分析。研究发现，PI3Kα和PI3Kβ在这些PTEN缺失的三阴性乳腺癌(TNBC)细胞中展现出截然不同的互作组，两者仅有约30%的重叠。在两种细胞系中均选择性富集于PI3Kβ的四个互作蛋白中，EPHA2是丰度最高且唯一与PI3Kβ在质膜上共定位的蛋白。进一步的免疫共沉淀(Co-IP)分析验证了内源性EPHA2在PTEN缺失的BT549和HCC70细胞中与PI3Kβ而非PI3Kα相互作用。有趣的是，在PTEN野生型(WT)细胞中，EPHA2与两种PI3K亚型的相互作用相当；而PTEN敲除(KO)则显著增强了EPHA2–PI3Kβ的互作，同时减少了EPHA2–PI3Kα的互作。相反，在PTEN缺失的BT549细胞中恢复PTEN表达，则显著削弱了外源性和内源性EPHA2与PI3Kβ的相互作用。这些结果表明，PTEN缺失特异性促进了EPHA2与PI3Kβ之间更强的结合。

PTEN作为蛋白酪氨酸磷酸酶通过去磷酸化PI3Kβ酪氨酸-962位点(Y962)调控PI3Kβ–EPHA2相互作用

研究团队进一步探究了PTEN缺失增强PI3Kβ–EPHA2相互作用的机制。PTEN不仅具有已知的脂质磷酸酶活性，还拥有蛋白酪氨酸磷酸酶活性。研究发现，与PTEN-WT细胞相比，PTEN-KO细胞中免疫沉淀的PI3Kβ（而非PI3Kα）的酪氨酸磷酸化(p-Tyr)水平显著增加。在稳定表达PTEN野生型(WT)、脂质磷酸酶活性缺陷型(G129E)、蛋白磷酸酶活性缺陷型(Y138L)或双缺陷型(C124S)突变体的PTEN缺失癌细胞系(BT549和HCC70)中，重新表达PTEN-WT或PTEN-G129E能显著降低PI3Kβ的p-Tyr水平，而PTEN-C124S或PTEN-Y138L突变体则几乎没有影响。这表明PTEN通过其蛋白磷酸酶活性调控PI3Kβ的酪氨酸磷酸化。Co-IP实验表明PTEN与PI3Kβ相互作用，并且底物陷阱突变体PTEN-C124S与PI3Kβ的结合显著强于PTEN-WT，支持PI3Kβ是PTEN的生理性底物。相应地，在PTEN缺失的BT549细胞中表达PTEN-WT或PTEN-G129E显著降低了PI3Kβ–EPHA2的相互作用，而PTEN-Y138L或PTEN-C124S则没有此效果。这提示PTEN作为蛋白磷酸酶调节PI3Kβ磷酸化及其与EPHA2的互作。

为了确定PTEN调控PI3Kβ的具体磷酸化位点，研究人员在PTEN-KO的HEK293T细胞中表达并纯化了Flag标记的PI3Kβ进行LC-MS/MS分析。该分析检测到PI3Kβ在酪氨酸962位(Y962)和苏氨酸930位(T930)存在磷酸化，这两个位点在物种间高度保守。在无细胞去磷酸化实验中，PTEN-WT和PTEN-G129E突变体（缺乏脂质磷酸酶活性但保留蛋白磷酸酶功能）能有效去磷酸化含有磷酸化Y962的合成PI3Kβ肽段，而蛋白磷酸酶缺陷突变体PTEN-Y138L和PTEN-C124S则不能。值得注意的是，所有PTEN变体都无法去磷酸化含有pT930的肽段，表明PTEN作为一种酪氨酸磷酸酶靶向PI3Kβ的Y962位点。

为了研究PI3Kβ在这些位点的磷酸化是否影响其与EPHA2的互作，研究构建了模拟非磷酸化(T930A, Y962F, T930A/Y962F)或模拟磷酸化(T930E, Y962E, T930E/Y962E)状态的PI3Kβ突变体。在PTEN缺失的BT549细胞中，与PI3Kβ-WT相比，Y962F和T930A/Y962F突变体显著削弱了与EPHA2的相互作用，而单独的T930A突变没有影响。相反，在PTEN-WT的MDA-MB-231细胞中，表达模拟磷酸化的T930E或T930E/Y962E突变体增强了PI3Kβ–EPHA2互作，而单独的T930E突变无显著影响。免疫荧光染色显示，模拟磷酸化的PI3Kβ-Y962E突变体主要定位于质膜并与EPHA2共定位，而非磷酸化的PI3Kβ-Y962F突变体主要位于细胞质。这些结果表明，PI3Kβ-Y962磷酸化增强了其与EPHA2的相互作用，并促进PI3Kβ在PTEN缺失细胞中的膜定位。总之，PTEN通过调控PI3Kβ Y962位的磷酸化来控制PI3Kβ–EPHA2相互作用，PTEN的缺失通过允许持续的PI3Kβ-Y962磷酸化来促进这种互作。

持续的PI3Kβ磷酸化支持PTEN缺失肿瘤的生长

为了评估PTEN缺失诱导的PI3Kβ酪氨酸磷酸化在肿瘤发生中的功能重要性，研究团队探究了磷酸化缺陷的PI3Kβ突变体能否模拟PI3Kβ基因敲除的效果，从而在体内抑制PTEN缺失肿瘤的生长。研究利用了源自同时缺失Pten和Trp53并敲除Pik3cb的乳腺癌基因工程小鼠模型(GEMM)的原发性PPB肿瘤细胞。虽然PPB细胞在体外生长良好，但在体内缺乏成瘤能力，这为评估不同PI3Kβ突变体的致癌功能提供了一个可操控的同基因平台。

研究团队用小鼠PI3Kβ-WT或磷酸化缺陷型PI3Kβ变体重构了PPB细胞。与在人类PTEN缺失癌细胞中的观察结果一致，添加回Y956F突变体（对应于人类的Y962F）或T924A/Y956F双突变体会减少PI3Kβ与EPHA2的结合，而单独的T924A突变没有明显影响。这表明小鼠PI3Kβ-Y956的去磷酸化削弱了其在PTEN缺失小鼠肿瘤中与EPHA2的相互作用。为了评估这种相互作用在体内的功能后果，研究人员将这些工程化的PPB肿瘤细胞原位移植到FVB小鼠的乳腺脂肪垫中。PI3Kβ-WT恢复了PPB细胞的致瘤潜力，而Y956F和T924A/Y956F突变体恢复肿瘤生长的能力显著减弱，并伴有Ki67染色减少，表明增殖能力受损。这些结果表明，PI3Kβ的磷酸化对于PTEN缺失的乳腺肿瘤生长至关重要。

研究将这一分析扩展到PTEN缺失的前列腺癌模型PC3细胞。在敲低内源性PI3Kβ后，研究人员过表达了WT或非磷酸化的人源PI3Kβ突变体(T930A, Y962F, 或T930A/Y962F)，并将这些工程化的PC3细胞移植到Balb/c裸鼠中。PI3Kβ-WT促进了强劲的肿瘤生长，而Y962F和T930A/Y962F突变体则大幅削弱了这种效应。同样，表达Y962F或T930A/Y962F双突变体的肿瘤显示出显著降低的Ki67水平。综上所述，这些数据表明，在多种PTEN缺陷的癌症模型中，PI3Kβ的酪氨酸磷酸化是驱动体内肿瘤发生的关键。

PI3Kβ-Y962磷酸化升高与人类乳腺癌和前列腺癌患者的PTEN缺失紧密相关

为了进一步评估PTEN介导的PI3Kβ^Y962磷酸化，研究团队开发了一种特异性识别人源PI3Kβ Y962位磷酸化的多克隆抗体，该抗体也与相应的小鼠位点(pY956)有交叉反应。通过蛋白质印迹和免疫荧光检测验证，该抗体可在多个细胞系中选择性检测过表达和内源性的p-PI3Kβ^Y962。

研究人员接下来评估了PTEN表达与p-PI3Kβ^Y962水平之间的关系。利用靶向5‘-非翻译区的shRNA敲低内源性PI3Kβ，然后恢复PI3Kβ-WT或-Y962F，构建了PTEN缺失的BT549和PC3细胞的同基因配对。免疫荧光分析显示，在BT549/PI3Kβ-WT和PC3/PI3Kβ-WT细胞中均检测到强烈的p-PI3Kβ^Y962染色信号，而在它们各自的Y962F对应细胞中该信号缺失。蛋白质印迹证实，PI3Kβ敲低降低了p-PI3Kβ^Y962水平，重新表达PI3Kβ-WT可恢复该水平，而Y962F突变体则不能。此外，在BT549细胞中异位表达PTEN显著降低了内源性p-PI3Kβ^Y962水平，而在PTEN-WT的MDA-MB-157细胞中通过CRISPR介导的PTEN敲除则导致p-PI3Kβ^Y962信号显著增加。这些数据共同表明，p-PI3Kβ^Y962受PTEN的严格控制。

使用经过验证的特异性抗p-PI3Kβ^Y962抗体，研究团队在两个独立的人类癌症患者队列中分析了PTEN缺失与p-PI3Kβ^Y962水平的关系。首先，对10例携带PTEN突变的TNBC病例和10例年龄与疾病分期匹配的PTEN野生型对照病例进行了多重免疫组化分析。引人注目的是，与PTEN野生型对照组相比，PTEN突变肿瘤患者的p-PI3Kβ^Y962水平显著更高。线性回归分析进一步揭示了该TNBC队列中PTEN表达与p-PI3Kβ^Y962水平呈强负相关。此外，在PTEN缺失的肿瘤组织内，邻近肿瘤巢的PTEN完整的基质细胞显示出比PTEN突变的肿瘤细胞低得多的p-PI3Kβ^Y962水平，这加强了临床样本中PTEN缺失与p-PI3Kβ^Y962升高之间的联系。

为了扩展这些发现，研究团队分析了106名临床特征相似的前列腺癌患者组成的大型队列。与TNBC数据一致，携带PTEN突变的前列腺肿瘤显示出比PTEN野生型肿瘤显著更高的p-PI3Kβ^Y962水平，并且在整个队列中，p-PI3Kβ^Y962水平与PTEN水平呈负相关。病理学Gleason评分用于对肿瘤侵袭性进行分层，评分为7分表示中期，8-10分反映高级别、预后较差的肿瘤。PTEN水平在高Gleason评分患者中显著较低，而p-PI3Kβ^Y962水平在这些相同的高级别肿瘤中显著升高。

总之，这些数据证明，p-PI3Kβ^Y962水平与PTEN缺失显著相关，并且与TNBC和前列腺癌的不良临床预后相关，凸显了其作为预后生物标志物的潜力。这些结果表明，评估p-PI3Kβ^Y962水平可能有助于识别PTEN缺失肿瘤的高危患者，并可能为未来靶向这一信号轴的治疗策略提供信息。

PI3Kβ磷酸化促进EPHA2结合以激活PTEN缺陷肿瘤细胞中的pERK/c-MYC和AKT信号通路

研究人员接下来探究了PI3Kβ-Y962磷酸化如何通过其与EPHA2的相互作用影响PTEN缺陷肿瘤细胞的下游信号传导。考虑到EPHA2作为一种受体酪氨酸激酶(RTK)，可以与AKT通路形成相互反馈调节环，并在多种癌症中促进PI3K/AKT和pERK/c-MYC信号传导，研究假设PTEN缺失使得PI3Kβ-Y962磷酸化得以增强，从而促进EPHA2结合并激活致癌通路。

支持这一假设的是，在PTEN缺失的乳腺癌模型（包括BT549细胞和源自同时缺失Pten和Trp53的TNBC GEMM的PP细胞）中，PI3Kβ的耗竭选择性地降低了pERK和c-MYC水平。这些发现表明，PTEN缺陷的肿瘤依赖PI3Kβ来维持pERK/c-MYC信号通路，该通路对实体瘤进展至关重要。

为了评估PTEN的磷酸酶活性在调节这一通路中的作用，研究人员将WT和突变型PTEN构建体重新引入PTEN缺失的BT549细胞。PTEN-WT和PTEN-G129E（脂质磷酸酶缺陷型）显著降低了pERK和c-MYC水平，而PTEN-Y138L（蛋白磷酸酶缺陷型）和PTEN-C124S（双磷酸酶缺陷型）则不能。这些结果表明，PTEN的蛋白磷酸酶活性（而非其脂质磷酸酶功能）对于抑制PTEN缺失癌症中的ERK/c-MYC通路至关重要。

研究接下来探究了PI3Kβ磷酸化在调节PTEN缺陷肿瘤细胞中pERK/c-MYC信号的作用。在敲低PI3Kβ的BT549细胞中，重新表达PI3Kβ-WT、T930A突变体或激酶失活的K805R突变体可恢复pERK和c-MYC的表达，而Y962F和T930A/Y962F突变体则未能挽救这一信号传导。在用WT或突变型PI3Kβ重构的PPB细胞中也观察到了类似的结果。在PTEN充足的MDA-MB-231细胞中，过表达模拟磷酸化的突变体PI3Kβ-Y962E和T930E/Y962E与PI3Kβ-WT或单独的T930E相比，显著增加了pERK和c-MYC水平，强调了PI3Kβ-Y962磷酸化对ERK/c-MYC激活的特异性贡献。

为了确定PI3Kβ–EPHA2相互作用是否参与此通路，研究人员在PTEN缺失的BT549细胞中破坏了EPHA2功能。EPHA2的基因敲除和药理抑制均显著降低了pERK和c-MYC蛋白水平，支持了PI3Kβ–EPHA2信号在驱动pERK/c-MYC激活中的作用。此外，在PI3Kβ耗竭的BT549细胞中，重新引入PI3Kβ-WT恢复了EPHA2活性，而Y962F和T930A/Y962F突变体则不能。

为了进一步阐明ERK–c-MYC轴作为p-PI3Kβ^Y962–EPHA2信号下游效应物在PTEN缺失细胞中的作用，研究团队检测了其对内源性PI3Kβ被敲低的BT549细胞的影响。重新表达PI3Kβ导致p-ERK1/2、p-cMYC^S62和总c-MYC蛋白水平增加。值得注意的是，通过shRNA沉默ERK或用ERK抑制剂进行药理抑制显著抑制了c-MYC蛋白水平，尤其是p-cMYC^S62，但不影响c-MYC的mRNA表达，表明ERK通过促进c-MYC稳定化而非转录来发挥上游功能，这与先前的研究一致。此外，阻断ERK或c-MYC活性均损害了在缺乏内源性PI3Kβ的BT549细胞中由PI3Kβ过表达诱导的增殖效应。这些发现表明，PI3Kβ-Y962磷酸化增强了EPHA2介导的ERK激活，从而稳定了c-MYC并驱动了PTEN缺陷肿瘤细胞的增殖。

由于在BT549-shPIK3CB细胞中重新表达PI3Kβ Y962F或T930A/Y962F突变体会导致p-AKT水平降低，其程度与激酶失活突变体PI3Kβ K805R观察到的相似，研究人员评估了这些磷酸化位点突变是否会损害脂质激酶活性。使用ADP-Glo脂质激酶检测法确认，尽管K805R缺乏激酶活性，但T930A、Y962F和T930A/Y962F突变体保留了熟练的脂质激酶功能。

有趣的是，尽管K805R突变体失去了催化活性并且p-AKT信号传导受损，但它仍保持了与EPHA2结合并促进ERK/c-MYC通路激活的能力。这些发现表明，PI3Kβ的磷酸化，独立于其酶活性，对于结合EPHA2并触发下游ERK/c-MYC信号传导是必需的。此外，Y962磷酸化对p-AKT激活也很重要，这一观察结果表明EPHA2相互作用增强了PI3Kβ在细胞膜上的可及性，从而在PTEN缺失的背景下促进了PIP2磷酸化和p-AKT信号传导。为了评估PTEN的蛋白磷酸酶功能是否影响PIP3水平，研究团队使用Echelon的ELISA试剂盒测量了稳定表达WT PTEN或脂质磷酸酶缺陷(G129E)、蛋白磷酸酶缺陷(Y138L)或双缺陷(C124S)突变体的PTEN缺失癌细胞系BT549中的相对PIP3/PIP2比值。PTEN-WT显著降低了PIP3/PIP2比值。正如预期，脂质磷酸酶缺陷的G129E突变体基本丧失了此效应，而蛋白磷酸酶缺陷的Y138L突变体仅表现出轻微的损害。PTEN-G129E/C124S对PIP3/PIP2比值没有影响。这些结果表明，PTEN的脂质磷酸酶活性是PIP3的主要调节因子，其蛋白磷酸酶功能贡献有限。

综上所述，这些发现支持了一个模型：PTEN缺失导致PI3Kβ在Y962位点过度磷酸化，从而加强了其与EPHA2的相互作用。这种相互作用促进了EPHA2的激活，进而驱动pERK/c-MYC信号传导并增强PI3Kβ介导的AKT激活，最终促进了PTEN缺陷癌症中肿瘤细胞的增殖。

SRC–EPHA2–PI3Kβ三元复合物驱动PTEN缺失肿瘤的致癌信号传导

鉴于p-PI3Kβ^Y962在PTEN缺失癌症中的关键作用，研究团队试图鉴定负责其磷酸化的酪氨酸激酶。研究人员首先应用了由Cantley实验室开发的基于基序的预测算法，对所有酪氨酸激酶磷酸化PI3Kβ Y962的潜力进行评分。该分析确定了主要来自EPHA家族(EPHA1、EPHA2、EPHA3)和SRC家族(FES、PYK2、ACK、LYN、SRMS)的候选激酶。

为了补充这种计算方法，研究团队使用60种针对排名靠前的激酶的酪氨酸激酶抑制剂进行了靶向化合物筛选。该筛选在PTEN缺失的BT549和PC3细胞中进行，这些细胞中的内源性PI3Kβ被替换为PI3Kβ-WT或PI3Kβ-Y962F突变体。筛选旨在识别能有效抑制表达PI3Kβ-WT的癌细胞，但对表达Y962F突变体的细胞效果减弱的化合物，从而突出可能特异性靶向p-PI3Kβ^Y962的抑制剂。值得注意的是，两种SRC抑制剂达沙替尼(dasatinib)和KX2-391成为筛选出的主要候选物，在BT549和PC3细胞系中均显著降低了PI3Kβ-WT细胞的生长，但对表达Y962F突变体的细胞效果减弱。这些结果表明，SRC抑制可能有效靶向PTEN缺失癌症中的p-PI3Kβ^Y962。事实上，达沙替尼不仅降低了SRC的磷酸化并抑制了细胞生长，还在多种PTEN缺失的癌细胞中显著降低了p-PI3Kβ^Y962和pERK/c-Myc蛋白水平。KX2-391也产生了类似的效果，同样降低了BT549细胞中的p-PI3Kβ^Y962和c-Myc。此外，这两种抑制剂均显著损害了表达PI3Kβ-WT的PPB细胞的生长，但对表达PI3Kβ-Y956F突变体的PPB细胞效果较差。这些结果表明p-PI3Kβ^Y962是一个可成药的靶点，可被激酶抑制剂有效抑制。

随后的机制研究表明，SRC或EPHA2的敲低均降低了PTEN缺失的BT549细胞中PI3Kβ-Y962的磷酸化和c-MYC水平。SR