BrNAC046 参与了采后中国花椰菜中过氧化氢诱导的叶片衰老过程

《Postharvest Biology and Technology》：BrNAC046 involved in hydrogen peroxide-induced leaf senescence of postharvest Chinese flowering cabbage

NAC转录因子BrNAC046通过调控叶绿素降解、ROS生成及细胞死亡相关基因促进中国花卉白菜采后叶衰老，并协同RCD1蛋白增强其转录活性，为采后保鲜提供新靶点。

　　

李丰军|任宝祥|李丽朗|孔向进|梁汉志|刘海|王玲|蒋月明

广东海洋大学食品科学与技术学院，广东省水产品加工与安全重点实验室，广东省亚热带果蔬加工科技创新中心，广东省海洋生物产品工程实验室，湛江524088，中国

摘要

中国结球白菜收获后的叶片衰老是导致品质下降的关键因素。已有研究表明过氧化氢（H₂O₂）和NAC（NAM/ATAF/CUC）转录因子（TFs）参与了叶片衰老过程，但NAC TFs调控H₂O₂诱导的叶片衰老的机制尚未完全阐明。在本研究中，我们鉴定出一种由衰老激活的NAC TF——BrNAC046，其表达可被外源100 mM H₂O₂诱导。BrNAC046通过与相关基因的启动子结合，激活了参与叶绿素分解（BrSGR2）、程序性细胞死亡（BrBFN1）和活性氧（ROS）产生的基因（BrRbohCL）。它与ROS信号传导中的核心蛋白BrRCD1的相互作用增强了BrNAC046的转录活性。在烟草和拟南芥中过表达BrNAC046会加速叶片衰老。我们的发现揭示了BrNAC046通过调节叶绿素降解、ROS产生和细胞死亡来诱导H₂O₂调控的叶片衰老，为理解中国结球白菜的采后衰老机制提供了新的分子依据。

引言

中国结球白菜（Brassica campestris L. ssp. chinensis var. utilis Tsen et Lee），作为华南地区的一种传统叶类蔬菜，具有优良的口感和高营养价值。与许多叶类蔬菜一样，中国结球白菜在收获后叶片会迅速衰老，导致严重的采后损失（Peng et al., 2023）。近年来，人们对中国结球白菜的采后衰老机制给予了极大关注。例如，脱落酸和甲基茉莉酸通过诱导衰老相关基因加速叶片衰老（Fan et al., 2020, Tan et al., 2018），而细胞分裂素、赤霉素、一氧化氮和褪黑素则通过抑制叶绿素降解和调节ROS平衡延缓叶片衰老（Fan et al., 2020, Li et al., 2021, Mou et al., 2025, Tan et al., 2019）。在转录水平上，NAC、WRKY、MYB、TCP、ERF和Dof转录因子已被证明参与衰老调控（Wang et al., 2021; Tan et al., 2018, Tan et al., 2016, Yue et al., 2025; Zeng et al., 2022）。然而，NAC转录因子在中国结球白菜采后ROS诱导的叶片衰老中的调控作用仍不明确，因此需要进一步研究。

作为叶片发育的最终阶段，衰老代表了一种受基因控制的程序性细胞死亡（PCD）过程。在植物中，PCD根据发生的生命周期分为两种类型：一种发生在发育过程中（发育性PCD，dPCD），另一种是对环境刺激的反应（环境性PCD，ePCD）（Daneva et al., 2016）。dPCD包括多种生殖和营养过程，如胚胎发生、种子成熟、花粉成熟、木质部形成和叶片衰老（Wang et al., 2023）。植物PCD由多种因素直接触发。在PCD过程中，ROS、SA和JA等信号分子在驱动细胞死亡中起关键作用（Valandro et al., 2020）。此外，参与核酸酶产生的关键基因（如BFN1（双功能核酸酶1）的表达上调。线粒体膜、液泡和叶绿体的破裂会释放细胞色素c和水解酶，并伴随叶绿素降解，最终导致细胞死亡（Valandro et al., 2020）。此外，极端环境条件（如病原体和温度）也会诱导细胞死亡（Lin et al., 2025）。

叶片衰老过程是一系列功能基因选择性表达的结果，这是一个由转录因子（TFs）组成的复杂转录调控网络调控的过程（Li et al., 2018）。在植物转录因子家族中，NAC结构域蛋白家族是最大的转录因子家族之一（Guo et al., 2021）。这些NAC TFs参与多种生物过程，如发育、衰老、激素信号传导以及生物和非生物胁迫响应（Guo et al., 2021）。然而，很少有NAC TF被证实能调控特定类型的细胞死亡。先前的研究表明，拟南芥的叶片衰老和发育性dPCD通过一个包含乙烯、miR164、ANAC092/ORE1和Ethylene-Insensitive2（EIN2）的三分支前馈调控环路相互关联（Kim et al., 2009）。在这个调控环路中，EIN2激活ANAC092但抑制其负调控因子miR164，从而促进ANAC092的积累。此外，一些NAC基因（包括ANAC041/79/87/102和VND-Interacting 2（VNI2/ANAC083）位于ANAC092的下游（Kim et al., 2014）。特别是VNI2和ANAC087在介导叶片衰老和木质部PCD中具有双重作用（Huysmans et al., 2018）。

H₂O₂是植物细胞中最丰富的ROS之一，它在调节植物生理过程中具有双重作用。已知低浓度的H₂O₂作为信号分子参与发育调控和适应非生物及生物胁迫（Mittler, 2017）。具体而言，外源施用低浓度H₂O₂可以激活抗氧化防御系统，从而提高植物对环境胁迫的耐受性（Nazir et al., 2020）。因此，采后用低浓度H₂O₂处理可以激活抗氧化系统，保持水果和蔬菜的品质（Zhang et al., 2024）。相反，细胞内H₂O₂的过度积累会加速植物衰老（Czarnocka and Karpiński, 2018）。这在采后园艺作物中尤为明显，高浓度的H₂O₂会加速衰老和品质下降。例如，外源施用H₂O₂可导致采后龙眼果实果皮褐变（Lin et al., 2014）。

先前的研究已经表明外源H₂O₂可以促进中国结球白菜的叶片衰老（Wang et al., 2022），但介导这种H₂O₂信号传导以执行衰老程序的关键转录因子尚未确定。在中国结球白菜中，一些NAC TFs（如BrNAC029/41/55/87）已被证实与叶片衰老有关，但它们与H₂O₂信号传导的关联尚未报道（Li et al., 2023）。本研究旨在鉴定并表征负责H₂O₂诱导的叶片衰老的NAC转录因子，重点关注BrNAC046。我们的发现有助于揭示衰老的潜在机制，并为开发采后保存策略和改良中国结球白菜品种提供分子基础。

实验材料与处理

中国结球白菜（品种‘49’）样本购自广州农贸市场。这些白菜在播种后30–40天的‘花蕾开放期’从当地农场收获，2小时内运送到市场，再在2小时内运送到实验室。仅选择外观均匀、无损伤或病害的样本进行实验。为了确定诱导衰老的最佳H₂O₂浓度，进行了浓度梯度实验

采后中国结球白菜叶片衰老过程中的外观变化、叶绿素含量、可溶性蛋白、MDA和H₂O₂含量以及相关基因的表达水平

为了确定诱导叶片衰老的最佳H₂O₂处理浓度，进行了梯度实验。如图S1所示，叶片衰老症状的严重程度明显依赖于H₂O₂浓度。在实验组中，50 mM和100 mM H₂O₂的处理在储存期间引发了更明显的叶片黄化现象，其中100 mM H₂O₂处理导致了最严重且一致的表型。因此，选择100 mM H₂O₂进行后续实验

讨论

H₂O₂对植物衰老的影响具有浓度依赖性。低浓度的H₂O₂作为信号分子参与发育和胁迫适应，而高浓度则转变为强烈的衰老促进因子（Lin et al., 2014）。在生理层面，叶片衰老过程中，高浓度的H₂O₂作为胁迫信号，加速叶绿素分解和养分再利用，从而提供必要的物质

结论

总之，本研究揭示了H₂O₂通过NAC TF依赖途径加速中国结球白菜采后叶片衰老的机制。我们的结果表明，H₂O₂诱导的转录激活因子BrNAC046直接与BrSGR2、BrRbohCL和BrBFN1的启动子结合，导致它们的转录激活。此外，BrNAC046与BrRCD1相互作用，从而增强BrNAC046的转录活性。总之，我们的研究

作者贡献声明

蒋月明：撰写 – 审稿与编辑，监督，项目管理，概念构思。李丰军：撰写 – 初稿，实验研究，数据分析。王玲：撰写 – 初稿，概念构思。梁汉志：方法学，实验研究。刘海：软件应用，方法学。孔向进：软件应用，方法学。任宝祥：方法学，实验研究。李丽朗：方法学，数据管理。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

作者感谢国家自然科学基金（项目编号：32302163）和国家重点研发计划（项目编号：2021YFD00500）的财政支持。