在Yarrowia lipolytica中工程化表达表面展示的聚乙烯降解酶，以促进低密度聚乙烯的生物降解

《Process Safety and Environmental Protection》：Engineering Surface-Displayed Polyethylene-Degrading Enzymes in Yarrowia lipolytica for Enhanced Low-Density Polyethylene Biodegradation

通过工程化酵母Yarrowia lipolytica Po1g并整合锰过氧化物酶和漆酶，结合表面显示技术与酪醇协同作用，显著提升了低密度聚乙烯（LDPE）的降解效率，并解析了酪醇通过代谢重编程和生物膜强化降解的机制。

　　

何定坤|刘飞|曲慧山|丁明珠|袁英进

中国天津大学合成生物学与生物制造学院，合成生物学国家重点实验室

摘要

聚乙烯（PE）废物的持续存在是一个重大的全球环境挑战，因为它具有天然的生物降解抗性，这限制了工程微生物在塑料废物处理中的应用。在这项研究中，使用Yarrowia lipolytica Po1g作为底盘菌株，开发了一种高效的低密度聚乙烯（LDPE）降解系统。通过筛选过氧化锰酶和漆酶，并结合荧光引导的表面展示系统，我们构建了两种工程菌株YME19和YME20，它们表现出强烈的氧化降解活性。Cu²⁺、1-羟基苯并三唑（HBT）和酪醇协同增强了经过紫外线（UV）预处理的LDPE薄膜的降解效果，其中酪醇的作用最为显著。经过7天的YME20处理后，LDPE薄膜的质量损失为2.92%（相当于5.84毫克）。这一过程伴随着明显的表面侵蚀，包括不规则的深坑、裂纹和孔隙密度的增加。同时，表面亲水性显著提高，水接触角减少了约10.57°。ATR-FTIR分析表明，由于含氧功能团的富集，发生了广泛的氧化修饰；而AFM和GC-MS分析证实了表面粗糙度的增加以及正十六烷的形成，这直接证明了PE碳链的断裂。转录组分析阐明了酪醇增强降解的机制。酪醇作为一种应激信号，诱导代谢重编程，抑制与生长相关的代谢过程，同时激活耐受性、DNA修复和自噬机制。此外，它通过细胞壁重塑和表面粘附增强了生物膜的形成，从而在塑料表面上维持了高降解活性。本研究阐明了酪醇在LDPE生物降解中的关键作用，并为利用工程酵母处理难降解聚合物废物提供了新的战略框架。

引言

塑料的广泛使用及其环境持久性带来了严重的生态挑战（Vidal等人，2024年；He等人，2025年）。聚乙烯（PE）占全球塑料产量的近三分之一，由于其高度稳定的碳-碳骨架，特别难以自然降解（Karaki等人，2024年；MacLeod等人，2021年）。传统的物理化学处理方法通常成本高昂或存在二次污染的风险（Orlando等人，2023年；Guselnikova等人，2023年；Coates和Getzler，2020年；Che等人，2025年；Li等人，2023a年），因此开发高效且环保的生物降解策略迫在眉睫（Li等人，2023b年；Zhu等人，2022年；Elsamahy等人，2023年）。

微生物对PE的降解本质上是一个酶介导的氧化降解过程（Jyotika等人，2020年）。已知的候选酶包括漆酶、过氧化酶和烷烃羟化酶等（Zhang等人，2022a年；Sun等人，2025a年）。其中，过氧化锰酶利用过氧化氢和Mn²⁺引发自由基反应，攻击聚合物链（De Oliveira等人，2021年；Zhang等人，2022b年）；而漆酶是一种多铜氧化酶（Orlando等人，2025年；Zhang等人，2020年），在添加Cu²⁺或1-羟基苯并三唑（HBT）等氧化还原介质后，其氧化效率显著提高（Tournier等人，2023年；Dorairaj等人，2021年）。然而，野生型微生物的降解效率通常较低，且酶在复杂环境中的稳定性和精确定位仍然是主要瓶颈（Zimmermann，2025a年；Zimmermann，2025b年）。

高效的PE生物降解不仅依赖于高效的酶，还关键依赖于微生物在疏水性固体表面的成功定殖和持续活性（Huang等人，2021年；Purohit等人，2025年；Liu等人，2025a年）。表面展示技术通过将异源酶锚定在细胞壁上，将工程菌株转化为具有催化活性的生物载体（Teymennet-Ramírez等人，2022年）。这种方法有望同时解决酶与底物之间的空间接近性问题，增强细胞粘附，并促进功能性生物膜的形成，从而克服传统分泌表达策略在固相降解场景中的固有局限性（Li等人，2024年）。Yarrowia lipolytica因其强大的蛋白质分泌能力、对疏水性底物的亲和力以及完善的遗传工具，成为构建此类工程菌株的理想底盘（Shang等人，2024年）。最近的研究进一步表明，小分子信号物质（如群体感应分子酪醇）可以调节细胞形态和生物膜形成，可能在调控工程菌株的定殖行为中起关键作用（Wang等人，2020年；Kovács和Majoros，2020年；Tarafdar等人，2021年；Yang等人，2023年）。此外，如紫外线（UV）照射或化学氧化等预处理方法可以在PE表面引入含氧功能团，提高微生物菌株的定殖能力和存活率（Mat Yasin等人，2022年）。目前，结合预处理和微生物降解的综合性策略被认为是PE生物修复的有效方法（Liu等人，2025b年）。

尽管用于构建高效降解菌株的合成生物学策略显示出潜力，但系统整合多源酶、构建高效表面展示平台以及与定殖相关的代谢调控，以协同增强低密度聚乙烯（LDPE）的降解性能，仍需进一步探索。在本研究中，使用Y. lipolytica Po1g作为底盘细胞，整合了来自不同来源的过氧化锰酶和漆酶基因。采用细胞外分泌和细胞表面展示表达策略构建了用于LDPE降解的工程菌株。此外，本研究使用正十六烷作为底物对工程菌株进行初步筛选，随后优化培养基并对酪醇介导的降解机制进行转录组分析，从而系统地提高了LDPE的降解效率。本研究不仅提供了高效的降解菌株资源，还阐明了酪醇介导的降解增强机制，为开发针对难降解塑料污染的生物修复策略提供了理论和技术支持。

材料、菌株、培养基和培养条件

本研究中使用的LDPE薄膜（类型ET31-FM-000151，厚度50微米）购自Good Fellow Company（英国）。在降解实验之前，LDPE薄膜接受了96小时的紫外线预处理。随后将其切割成约1.0厘米×1.0厘米的片状，并通过浸泡在75%乙醇中20分钟进行灭菌，以确保彻底消毒。本研究中使用的底盘菌株为Y. lipolytica Po1g。所有使用的菌株总结在表1中。

构建用于细胞外分泌LDPE降解酶的工程菌株

鉴于过氧化锰酶在LDPE降解中的关键作用以及信号肽对蛋白质分泌的决定性影响（De Oliveira等人，2021年；Barrero等人，2018年），本研究系统评估了不同的过氧化锰酶-信号肽组合，旨在确定最有效的配对，以增强酶的分泌和LDPE的降解性能。为此，选择了四种异源过氧化锰酶基因（Cesmnp、Irlmnp、Phcmnp和Trvmnp）

结论

本研究成功构建了具有高效LDPE降解能力的表面展示菌株YME19和YME20，为未来的塑料生物转化研究提供了宝贵的微生物资源。在此基础上，通过优化培养基成分进一步提升了降解性能。经过7天的YME20处理后，LDPE薄膜的质量损失为2.92%。YME20的主要降解产物是正十六烷。

CRediT作者贡献声明

袁英进：监督工作。何定坤：撰写原始草稿、可视化处理、数据整理、概念构建。刘飞：撰写原始草稿、实验研究、数据整理、概念构建。曲慧山：验证结果、实验研究、数据整理。丁明珠：撰写、审稿与编辑、监督工作、概念构建。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本研究得到了中国国家重点研发计划（2024YFA0919000）和中国国家自然科学基金（22578322）的支持。