《Exploration》：Spherical Nucleic Acid Stabilized Cage Type Three-Dimensional Electrochemiluminescence Probe for Sensitive and Amplification-Free Diagnosis of Infectious Diseases
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本文开发了一种基于球形核酸（SNA）稳定的笼型三维（3D）电化学发光（ECL）探针，与纸基双极电极（p-BPE）传感器结合，用于快速、灵敏、无核酸扩增的传染病床旁（POC）诊断。该探针利用Ru(dcbpy)3Cl2掺杂的NH2-MIL-101(Fe)金属有机框架（MOF）构建，经聚多巴胺（PDA）和SNA表面修饰，发光效率提升103倍。该系统可在约15分钟内检出低至3拷贝/μL的Mpox和SARS-CoV-2核酸，临床验证与定量聚合酶链反应（qPCR）相比灵敏度与特异性均达100%，为传染病快速精准诊断提供了新范式。
引言
快速、超灵敏的床旁检测（POC）病原体核酸对于传染病防控至关重要。然而，目前基于核酸扩增的金标准方法存在耗时长、依赖专业实验室和人员的局限，而免疫检测虽操作简单但灵敏度有限，存在检测窗口期。因此，开发无需核酸扩增的新型POC诊断技术迫在眉睫。当前的低丰度核酸POC检测方法主要分为序列复制（如环介导等温扩增、重组酶聚合酶扩增、滚环扩增等）和信号放大（如CRISPR、场效应晶体管、表面等离子体共振、电化学）两大类。序列复制法易产生非特异性扩增导致假阳性，信号放大法中，电化学发光（ECL）方法结合了化学发光和电化学的优势，具有背景信号低、灵敏度高、线性范围宽、易于集成微型电子系统等特点，在开发无扩增、超灵敏POC核酸检测方面展现出巨大潜力。近年来，研究人员致力于通过非标记方法或富集发光分子来提高无扩增超灵敏ECL核酸分析的性能，其中，使用金属有机框架（MOF）作为载体负载更多发光分子并增强电子转移是有效策略。然而，这些探针通常在液相中因化学修饰过程中的不稳定键合或材料降解而导致发光分子泄漏，影响整体性能。
笼型三维ECL探针增强核酸检测的原理
本研究旨在开发一种基于笼型三维（3D）ECL探针的POC核酸检测方法，用于病原体核酸的灵敏、无扩增检测。该方法的核心是球形核酸（SNA）稳定的笼型3D ECL探针，其与便携式、易于使用的设备及纸基双极电极（p-BPE）ECL生物传感器耦合，实现POC检测。该设备主要包括遮光光池、p-BPE装置、光电倍增管、信号触发与处理模块以及用于人机交互的触摸屏。p-BPE装置成本低廉（单次使用约0.4美元），易于制造。完整的工作流程包括热裂解介导的样品制备、捕获探针修饰磁珠（MB-CP）对RNA靶标的富集、与笼型3D ECL报告探针的夹心杂交，以及将杂交复合物与共反应物三丙胺（TPA）加入p-BPE装置，整个过程约15分钟。在20 V电位下，掺杂在Fe-MOF中的Ru2+和TPA各失去一个电子，分别转化为Ru3+和TPA•+，随后TPA•+去质子化生成TPA•，后者进一步与Ru3+反应生成激发态Ru2+*，最终Ru2+*弛豫回基态，产生优异的ECL发射。整个无扩增、超灵敏检测流程无需专用基础设施和复杂仪器。
SNA稳定的笼型三维ECL探针的构建
为提升检测性能，本研究选择水稳定性优异的Fe-MOF作为发光分子的载体。在制备[Ru(dcbpy)3Cl2]掺杂的Fe-MOF（Fe-Ru-MOF）过程中，Fe3+作为路易斯酸，2-氨基对苯二甲酸和Ru(dcbpy)3Cl2作为路易斯碱，基于Fe3+与羧基的配位形成MOF结构。形态和元素分析证实Ru(dcbpy)3Cl2成功掺杂到Fe-MOF晶体中。为实现探针在超灵敏检测中的稳定修饰并获得高灵敏度与超低背景，本研究创新性地通过多巴胺（DA）的自氧化原位合成聚多巴胺（PDA）层对Fe-Ru-MOF表面进行修饰，为核酸探针提供结合位点。随后，使用SNA标记的报告序列作为稳定剂，通过SNA与PDA之间的强分子间作用力进一步提高探针负载和结构稳定性。透射电子显微镜、动态光散射粒径、Zeta电位和紫外-可见光谱结果均证实了笼型3D ECL探针的成功合成。非特异性吸附评估实验表明，在优化条件下可避免非特异性吸附。
ECL性能评估
通过比较相同摩尔浓度下Ru(dcbpy)3Cl2掺杂的MOF晶体与普通Ru(dcbpy)3Cl2分子的发光效率，评估了笼型3D ECL探针的ECL性能。结果显示，Fe-Ru-MOF的ECL效率比普通Ru(dcbpy)3Cl2分子提升了约103倍，ECL强度是后者的1.8倍。循环伏安法和电化学阻抗谱测试表明，MOF结构中的金属位点（Fe3+）增强了MOF的导电性。每个直径约400 nm的Fe-Ru-MOF载体可负载约4.18 × 105个Ru(dcbpy)3Cl2分子，其优异性能归因于发光分子的高负载量以及Fe-Ru-MOF结构中加速的电子和离子转移。此外，PDA和SNA修饰不影响MOF的ECL性能。浸泡实验表明，MOF及MOF基探针具有良好的化学稳定性。综上，成功制备的改性Fe-Ru-MOF探针展现出优异的ECL性能和化学稳定性，在无扩增、超灵敏检测中具有潜力。
便携式ECL核酸生物传感系统的仪器化
便携式ECL设备尺寸紧凑，主要包括中央控制单元、光电倍增管驱动卡、检测室、光电倍增管和触摸屏。直流变压器模块为p-BPE上的ECL反应提供不同驱动电压。光电倍增管垂直放置在p-BPE上方并密封在检测室内，以最大化光子接收并最小化外部光子影响。评估表明，该生物传感系统背景噪声低。对可能影响系统性能的主要参数（激发电压、上样体积）进行优化后，确定20 V激发电压和15 μL上样体积可获得更高的信噪比。为实现最佳检测性能，进一步优化了ECL探针体积和Na+浓度等主要参数，确定50 μL ECL探针和100 mM Na+条件下信噪比更高。Na+的屏蔽作用可减少ECL探针、MB-CP和靶标之间的电荷排斥，促进夹心杂交。通过监测不同时间点的ECL计数，确定10分钟孵育时间可产生最大ECL信号同时保持较低背景。这些结果表明，所提出的ECL检测方法简单、快速、成本低、用户友好，能满足传染病POC诊断的迫切需求。
笼型三维ECL探针增强核酸检测的性能指标
灵敏度和特异性是该检测方法可行性的关键因素。针对Mpox靶标设计的检测体系，ECL信号强度随输入靶标浓度增加而逐渐增强，在33 aM至3.3 × 1010aM范围内呈现良好的线性关系，检测限低至5 aM。与基于PCR的方法相比，该检测限更低，检测范围更广，显示出优异的核酸检测性能。选择性评估表明，仅在Mpox存在时产生显著的ECL信号，对其他同源病毒核酸交叉活性低。该笼型3D ECL探针增强检测法具备快速、高灵敏、宽动态范围和可接受的特异性等优势。进一步评估其对其他病原体核酸的通用性，将探针序列替换为SARS-CoV-2对应靶标序列后，检测性能与Mpox相当，同样实现了5 aM的检测限和33 aM至3.3 × 1010aM的线性检测范围，且特异性良好。
使用临床样本验证Mpox和SARS-CoV-2的POC检测
鉴于该检测方法的优异性能，进一步评估了其临床应用潜力。针对Mpox，尽管它是双链DNA病毒，但已证实感染个体会产生Mpox RNA转录本。研究收集了10名Mpox患者和10名健康志愿者的多种体液样本，所有样本均经过定量聚合酶链反应验证。所提出的检测方法正确识别了所有Mpox阳性和阴性样本，所有阳性样本的ECL信号和ECL比值均显著增强。通过受试者工作特征曲线分析确定了最佳截断值，曲线下面积均大于0.99。为简化工作流程，评估了热裂解和RNA提取试剂盒两种样品制备方法的效果，两者在检测各样本时产生相似的ECL比值，表明该方法具有稳健性，允许使用热裂解等简单样品处理程序。与临床样本的标准逆转录定量聚合酶链反应结果相比，该检测方法表现出100%的灵敏度和特异性。进一步验证该方法在COVID-19诊断中的效力，对10名疑似COVID-19患者和10名健康志愿者的临床鼻咽拭子RNA提取物进行分析，同样正确识别了所有阳性和阴性样本，受试者工作特征曲线下面积为1.0，灵敏度和特异性均为100%。这些结果表明，本研究提出的检测方法即使使用未提取的样本也能提供快速、准确的病原体核酸检测，有望实现POC诊断的关键步骤。
无扩增、超灵敏核酸生物传感器的性能比较分析
无扩增、超灵敏核酸生物传感器的发展对于快速、准确的病原体检测至关重要。目前的无扩增核酸检测方法主要利用CRISPR、表面等离子体共振、电化学、电化学发光及其组合。作为代表性的生化信号放大策略，CRISPR/Cas系统具有靶标依赖性反式切割机制，可实现高度特异性的靶标识别和对邻近报告分子的高效切割，在与多种信号读出方式结合时展现出理想的信号转导能力和广泛的适用性。同时，物理信号放大机制也极大地促进了灵敏度提升。电化学和电化学发光都具有低成本、结构简单、微型化和高灵敏度等显著优势。然而，复杂的临床信号可能会干扰电化学传感器的读数，影响对未纯化临床样本（尤其是低丰度靶标样本）的准确分析。相比之下，电化学发光由于其独特的发光机制，通常具有较高的信噪比。现有的核酸检测电化学发光方法主要集中于提高电化学发光探针的发光效率以进一步提升分析性能，但受检测灵敏度、检测时间和便携性等因素限制。与这些方法相比，本研究提出的笼型三维电化学发光探针增强核酸检测法在灵敏度、周转时间、动态范围和便携性方面更具优势。此外，该方法兼容热裂解临床样本，无需进一步的核酸提取。得益于其简单性，本研究构建了便携式电化学发光检测仪器与低成本纸基双极电极电化学发光生物传感器相结合的系统，用于Mpox和SARS-CoV-2的快速、便携、超灵敏床旁检测。总体而言，结果表明所提出的检测方法有潜力成为传染病床旁诊断的一个有前景的范例。
结论
本研究制备了一种笼型三维电化学发光报告探针，用于病原体核酸的无扩增、超灵敏检测。发光分子的高负载能力，以及聚多巴胺和球形核酸介导的表面修饰，显著增强了电化学发光性能和化学稳定性。此外，研究结果表明，增强的电化学发光检测法在检测时间、检测限、宽检测范围和简单操作方面表现出色。本研究还构建了便携式电化学发光检测仪器与低成本纸基双极电极电化学发光生物传感器相结合的系统，可实现Mpox和SARS-CoV-2的快速、便携、超灵敏床旁检测。总之，本研究结果显示了所开发的球形核酸稳定的笼型三维电化学发光探针增强核酸检测法在传染病床旁诊断中的潜力。
