丹宁酸修饰CuInP2S6纳米片：多靶点协同治疗策略攻克顽固性气道炎症

《Exploration》：Surmounting Recalcitrant Airway Inflammatory Disorders With a Multi-Targeting Therapeutic Strategy by Tannic Acid-Modified CuInP2S6 Nanosheets

本研究开发了一种丹宁酸（TA）修饰的CuInP2S6（CIPS）纳米片（C-TA1）多功能纳米平台。该平台通过清除细胞游离DNA（cfDNA）抑制Toll样受体9（TLR9）介导的炎症通路，同时具备抗氧化、抗菌（含耐药菌）及抗病毒（SARS-CoV-2）活性。在LPS诱导的嗜中性粒细胞性和OVA诱导的嗜酸性粒细胞性气道炎症小鼠模型中，C-TA1均能有效减轻炎症、调节紊乱的气道菌群，展示出一种针对顽固性气道炎症的全新多靶点治疗策略。

　　

1. 引言：顽固性气道炎症的挑战与新靶点

严重的顽固性气道炎症性疾病，如慢性鼻窦炎伴鼻息肉（CRSwNP）、哮喘等，因其高发病率和高昂的医疗成本而备受关注。临床研究表明，CRSwNP患者样本中同时存在嗜中性粒细胞性和嗜酸性粒细胞性炎症，这可能是传统单靶点治疗策略效果有限的原因。细胞游离DNA（cfDNA）作为一种新兴的炎症介质，通过参与形成胞外诱捕网（如NETs和EETs），在两类炎症反应中均扮演关键角色。此外，过量的活性氧氮物种（RONS）积累和病原体感染也加剧了炎症进展。因此，开发能够同时清除cfDNA、抗氧化和抗病原体的多功能纳米平台，对于治疗顽固性气道炎症至关重要。本研究旨在利用二维（2D）纳米材料构建一种多靶点治疗平台。

2. 临床样本分析：揭示cfDNA与混合型炎症的相关性

对CRSwNP患者和健康志愿者鼻黏膜及鼻腔分泌物的分析发现，患者鼻腔分泌物中的cfDNA水平显著高于健康志愿者。免疫荧光染色显示，患者鼻息肉中与中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）相关的瓜氨酸化组蛋白H3（CitH3）和淋巴细胞抗原6G（Ly6G）阳性区域，以及与嗜酸性粒细胞胞外诱捕网（EETs）相关的嗜酸性粒细胞阳离子蛋白（ECP）和髓过氧化物酶（MPO）阳性区域均显著增加。这证实了cfDNA与CRSwNP患者中嗜中性粒细胞/嗜酸性粒细胞混合型炎症的存在密切相关，提示cfDNA是一个有潜力的治疗靶点。

3. 多功能纳米片C-TA₁的制备与表征

研究选用具有大比表面积和良好生物相容性的二维材料CuInP₂S₆（CIPS）作为基础。通过锂离子插层法剥离得到CIPS纳米片，并策略性地将具有抗氧化能力的天然多酚化合物丹宁酸（TA）锚定在其表面，制备了不同TA覆盖比例的功能化纳米片（C-TA₁， CIPS:TA重量比为1:1）。原子力显微镜（AFM）和透射电子显微镜（TEM）证实了其片状纳米结构。表征结果显示，TA修饰成功，C-TA₁具有良好的稳定性、低细胞毒性和低溶血性，适合生物医学应用。

4. C-TA₁的多功能抗炎机制验证

4.1 cfDNA清除与TLR通路抑制

C-TA₁能通过氢键作用高效结合并清除cfDNA以及由cfDNA触发形成的中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）。在细胞实验中，它能减少LPS刺激的气道上皮细胞释放cfDNA，并抑制CpG（一种TLR9激动剂）刺激的中性粒细胞产生NETs。更重要的是，利用表达人TLR9（hTLR9）的HEK细胞模型证实，C-TA₁能有效抑制cfDNA类似物CpG对TLR9的激活，从而阻断下游的核因子-κB（NF-κB）炎症信号通路。

4.2 强大的抗氧化能力

得益于TA的酚羟基，C-TA₁表现出显著的清除自由基能力。体外实验表明，它能有效清除ABTS⁺、DPPH·、·O₂^?等多种活性氧物种。在LPS刺激的气道上皮细胞中，C-TA₁处理能显著降低细胞内活性氧（ROS）水平，证实了其细胞内的抗氧化功效。

4.3 广谱抗病原体活性

C-TA₁继承了CIPS的物理抗菌特性，并对TA的抗菌性能进行了补充。它对革兰氏阴性菌（如大肠杆菌）、革兰氏阳性菌（如金黄色葡萄球菌）乃至氨苄青霉素和卡那霉素耐药的大肠杆菌均表现出剂量依赖性的生长抑制能力。活/死细菌染色和扫描电镜观察证实了其杀菌效果及对细菌形态的破坏。此外，假病毒中和实验证明，C-TA₁能有效抑制野生型SARS-CoV-2及其奥密克戎BA.5变体假病毒对细胞的感染，保留了CIPS的抗病毒潜力。

5. 体内生物分布与安全性评估

对健康小鼠连续4天鼻内给药C-TA₁，主要器官的组织病理学检查和血清生化指标（如ALT、AST、CREA）均未显示明显损伤，证明了其良好的体内生物相容性。利用Cy5荧光标记纳米片的体内分布研究表明，经鼻给药后，C-TA₁能快速在鼻腔和肺部炎症部位聚集，且TA修饰延缓了其生物降解，延长了在病灶部位的滞留时间，有利于发挥治疗作用。仅微量纳米片进入循环系统，并能被快速清除。

6. 在动物模型中的治疗效果评估

6.1 缓解LPS诱导的嗜中性粒细胞性气道炎症

在脂多糖（LPS）诱导的小鼠嗜中性粒细胞性气道炎症模型中，C-TA₁治疗显著降低了支气管肺泡灌洗液（BALF）中的cfDNA水平、总细胞计数和细菌载量。肺组织H&E染色显示炎症细胞浸润减少，临床评分改善；PAS染色表明黏液分泌和杯状细胞增生得到抑制。同时，肺组织中促炎因子IL-8和IL-17A的mRNA表达下调，BALF中的氧化应激指标丙二醛（MDA）水平降低，超氧化物歧化酶（SOD）活性恢复。

6.2 缓解OVA诱导的嗜酸性粒细胞性气道炎症

在卵清蛋白（OVA）诱导的小鼠嗜酸性粒细胞性气道炎症（模拟过敏性哮喘）模型中，C-TA₁展现了比阳性药物地塞米松（DEX）更优异的cfDNA清除效果。它能显著降低BALF中的cfDNA、总细胞数和细菌数，减轻肺组织和鼻黏膜的炎症细胞浸润及黏液高分泌。免疫荧光染色和流式细胞术分析进一步证实，C-TA₁处理减少了肺组织中嗜酸性粒细胞（ECP阳性）浸润、IL-5表达以及中性粒细胞（CitH3和Ly6G阳性）浸润。此外，它还能下调Th2型炎症因子IL-4和IL-5的表达，并改善体内的氧化应激状态。

7. 调节紊乱的气道菌群

通过对小鼠BALF进行16S rRNA基因测序，研究发现OVA炎症导致气道菌群α多样性下降，特定菌群（如变形菌门、伽马变形菌纲）丰度发生紊乱。C-TA₁治疗能够逆转这些变化，恢复气道菌群组成，使其更接近健康对照组。例如，它降低了与炎症增强相关的假单胞菌目等的丰度。这表明C-TA₁的抗炎治疗有助于恢复失调的气道微生态，而菌群平衡的恢复也可能进一步促进炎症消退。

8. 结论与展望

本研究针对顽固性气道炎症中cfDNA、RONS和病原体感染等多重病理驱动因素，成功设计并合成了多功能TA修饰CIPS纳米片（C-TA₁）。该纳米平台集高效cfDNA清除（抑制TLR9/NF-κB通路）、强效抗氧化、广谱抗病原体（包括耐药菌和病毒）活性于一体。在嗜中性粒细胞性和嗜酸性粒细胞性两种典型气道炎症小鼠模型中，C-TA₁均能有效缓解炎症、调节免疫细胞浸润、改善氧化应激并恢复紊乱的气道菌群，且展现出良好的生物安全性。其治疗效果优于单独的CIPS、TA或TA覆盖比例更高的C-TA₂，凸显了适宜的TA修饰比例与二维纳米结构协同构建多靶点治疗平台的重要性。这项工作为治疗严重的顽固性气道炎症性疾病提供了一种全新的、有前景的多靶点协同治疗策略，也为其他难治性炎症疾病的治疗提供了新思路。