《Cells》：Role of Aspartate in Immune Response and Mortality in a Polymicrobial Sepsis Model: Insights from Metabolomics and Transcriptomics
Min Ji Lee,
Bo Mi Kim,
Se Rin Choi,
Seongmin Kim,
Ye Jin Park,
Yun-Seok Kim,
Kihwan Choi,
Chang June Yune,
Tae Nyoung Chung and
Kyuseok Kim
+ 10 authors
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本文通过整合代谢组学与转录组学分析，发现在脓毒症动物和患者模型中，免疫细胞内天冬氨酸（Asp）水平显著降低，且与免疫麻痹（endotoxin tolerance）和吞噬功能（phagocytosis）受损密切相关。体内补充其前体L-鸟氨酸-L-天冬氨酸（LOLA）可提高脓毒症大鼠的生存率、增强细菌清除（CFU）并减轻急性肾损伤（AKI）。研究提示，胞内天冬氨酸（ASP）水平是脓毒症免疫功能障碍的关键代谢物，有望成为评估免疫状态的新型生物标志物和治疗靶点。
脓毒症免疫功能障碍的新视角：胞内天冬氨酸耗竭及其治疗潜力
脓毒症是一种由宿主对感染反应失调引起的、危及生命的器官功能障碍综合征。其免疫病理学是异质且动态的。除了早期的高炎症反应，许多患者还会发展出严重且持续的免疫抑制（即免疫麻痹），这与继发性感染和死亡风险增加密切相关。尽管靶向免疫疗法（如PD-1/PD-L1阻断、白细胞介素-7等）在临床前研究中显示出潜力，但临床转化面临挑战，部分原因在于缺乏实时评估免疫状态和可靠的生物标志物。本研究旨在探索脓毒症相关免疫功能障碍中的潜在代谢机制，重点关注天冬氨酸的作用。
1. 脓毒症导致内毒素耐受与吞噬功能受损
研究首先在盲肠匀浆诱导的脓毒症大鼠模型中，评估了免疫细胞的功能状态。结果发现，在脓毒症诱导24小时后，与假手术组相比，脓毒症大鼠的外周血单个核细胞和脾细胞在脂多糖刺激后产生的肿瘤坏死因子-α显著减少，这表明存在内毒素耐受现象。同时，脓毒症动物的外周血单个核细胞的吞噬活性也明显降低，这些结果为脓毒症相关的免疫功能障碍提供了直接的实验证据。
2. 多组学分析揭示天冬氨酸是脓毒症的关键差异代谢物
为系统探究脓毒症中免疫细胞功能异常的代谢基础，研究者对假手术组和脓毒症组大鼠的外周血单个核细胞进行了代谢组学分析。通过气相色谱-飞行时间质谱和超高效液相色谱-线性离子阱-静电场轨道阱串联质谱分析，多元统计分析（如主成分分析和偏最小二乘判别分析）显示，两组样本的代谢谱在脓毒症进程中有明显分离，表明脓毒症导致了广泛的内源性代谢重塑。进一步的热图及通路分析发现，包括甘氨酸、赖氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和脯氨酸在内的多种氨基酸生物合成途径在脓毒症组中显著下调。其中，胞内天冬氨酸水平的降低尤为一致。后续采用酶联免疫吸附测定法在脾细胞中进行验证，证实脓毒症组的细胞内天冬氨酸水平比假手术组降低了约26%。
3. 补充天冬氨酸前体LOLA改善脓毒症预后与器官功能
基于上述发现，研究者假设恢复天冬氨酸水平可能改善脓毒症结局。他们在体内实验中，对脓毒症大鼠补充了天冬氨酸的来源——L-鸟氨酸-L-天冬氨酸。结果显示，LOLA治疗将脓毒症大鼠的14天生存率从12.5%提高至37.5%。在器官功能方面，LOLA治疗显著降低了血清肌酐水平，表明减轻了急性肾损伤，但对丙氨酸氨基转移酶（肝损伤标志物）无显著影响，提示其保护作用具有器官特异性。此外，血液化学和电解质（如葡萄糖、白蛋白）水平在LOLA组与未治疗组间无显著差异。
4. LOLA增强细菌清除与免疫细胞反应性
为了解LOLA改善生存的潜在机制，研究者检测了细菌清除能力和细胞因子反应。结果显示，LOLA治疗显著降低了脾组织中的细菌负荷。在离体实验中，从LOLA治疗的脓毒症动物中分离的外周血单个核细胞和脾细胞，在脂多糖刺激后产生的肿瘤坏死因子-α水平高于未治疗的脓毒症动物，表明其内毒素耐受状态得到改善。体外实验使用人单核细胞系THP-1构建的内毒素耐受模型也证实，LOLA能以剂量依赖的方式，在有无脂多糖刺激的条件下均增加肿瘤坏死因子-α的产生。
5. 转录组学揭示天冬氨酸合成关键酶GOT1下调
为了从基因表达层面解释脓毒症中胞内天冬氨酸水平降低的原因，研究者对脾细胞进行了RNA测序分析。通过筛选差异表达的酶，并进行京都基因与基因组百科全书通路富集分析，发现“丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢”通路显著富集。在天冬氨酸的生物合成通路中，谷草转氨酶1的基因表达在脓毒症中显著下调，而其上游的几个酶变化不显著。通过实时定量聚合酶链反应和蛋白质印迹法在蛋白水平验证，脓毒症脾细胞中GOT1的mRNA和蛋白表达均降低，而GOT2的mRNA表达虽有增加，但蛋白水平无显著变化。
6. GOT1抑制导致天冬氨酸减少并损害吞噬功能
为验证GOT1的功能，研究者在体外通过药理学方法（使用抑制剂氨基氧乙酸）或小干扰RNA敲低的方式抑制M1型巨噬细胞中的GOT1。两种方法均导致细胞内天冬氨酸水平显著下降。在大鼠外周血单个核细胞中，GOT1的药理学抑制显著降低了细胞的吞噬功能，而同时补充LOLA或天冬氨酸能部分恢复其吞噬能力。这直接证明了GOT1-天冬氨酸轴在维持免疫细胞吞噬功能中的关键作用。
7. 电子传递链抑制同样减少天冬氨酸并影响免疫
考虑到天冬氨酸的生物合成与线粒体功能紧密相连，研究者进一步探讨了电子传递链功能受损的影响。在M1型巨噬细胞中，使用电子传递链复合物I、III、V的抑制剂处理后，细胞内天冬氨酸水平分别下降了约71%、69%和59%。在大鼠外周血单个核细胞中，这些电子传递链抑制剂同样导致了吞噬功能的减弱。有趣的是，在复合物I被抑制的情况下，补充LOLA或天冬氨酸能显著恢复吞噬功能，但在复合物III或V被抑制的情况下则效果不显，提示天冬氨酸的补救效应可能依赖于特定的代谢背景。
8. 脓毒症患者外周血单个核细胞中天冬氨酸水平降低
为评估临床相关性，研究者收集了健康志愿者和脓毒症患者的外周血单个核细胞进行分析。代谢组学分析显示，两组样本的代谢谱存在明显分离。靶向液相色谱-三重四极杆质谱分析和比色法检测均一致证实，脓毒症患者外周血单个核细胞内的天冬氨酸水平显著低于健康志愿者。此外，天冬氨酸水平与疾病严重程度评分APACHE II以及血乳酸水平呈负相关趋势，尽管未达到统计学显著性，但仍提示其与疾病严重程度存在潜在联系。
9. 讨论与意义
本研究通过多组学整合与功能验证，首次系统阐述了细胞内天冬氨酸耗竭是脓毒症相关免疫抑制的一个特征。在脓毒症状态下，免疫细胞内天冬氨酸的减少与细胞因子反应性降低和吞噬功能受损直接相关。体内补充其前体LOLA能改善生存、增强细菌清除并减轻器官损伤，展现了治疗潜力。
天冬氨酸在癌症生物学中已被广泛研究，涉及细胞增殖、生存和血管生成，但其在脓毒症中的作用此前尚未明确。本研究表明，天冬氨酸对于维持免疫细胞（尤其是高代谢活性的细胞）的功能至关重要。GOT1的下调可能是导致脓毒症中天冬氨酸减少的关键因素。
脓毒症的免疫反应具有高度异质性，这使得精准免疫调节治疗面临挑战。目前临床尚缺乏常规、快速评估免疫细胞功能状态的方法。胞内天冬氨酸水平有望成为一个实用的、可量化的免疫抑制生物标志物，用于指导个性化治疗。LOLA作为一种已被美国食品药品监督管理局批准用于肝病治疗的药物，具有已知的安全性，这为其快速转化为脓毒症的辅助治疗策略提供了便利。
10. 研究局限与展望
本研究也存在一些局限性。首先，未能明确天冬氨酸发挥免疫调节作用的具体免疫细胞亚型（如T细胞、B细胞、单核细胞或巨噬细胞）。其次，为方便后续临床转化，体内实验使用了LOLA而非天冬氨酸本身，尽管体外实验证实两者效果相当。再者，除了GOT1通路，未深入探索其他与天冬氨酸代谢相关的途径。最后，尽管盲肠匀浆模型具有良好的可重复性，但与临床脓毒症的复杂性仍存在差距。
结论
细胞内天冬氨酸缺乏与脓毒症免疫抑制密切相关。在脓毒症大鼠模型中，补充天冬氨酸前体LOLA可改善免疫功能和生存率。这一发现在脓毒症患者的外周血单个核细胞中得到一致验证，患者细胞内天冬氨酸水平显著降低。综上所述，天冬氨酸不仅有望成为脓毒症免疫抑制的新型生物标志物，也可能是一个有价值的治疗靶点，为脓毒症的精准免疫代谢治疗提供了新的思路。
