《Cells》：Neurophysiological In Vitro Model of Amyloid-β-Induced Deficits of Hippocampal LTP Involving Neuronal Adenosine A2A Receptor Dysfunction Through CD73
Francisco Q. Gon?alves,
Henrique B. Silva,
?ngelo R. Tomé,
Paula Agostinho,
Rodrigo A. Cunha and
Jo?o P. Lopes
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本研究建立了一个可靠的体外神经生理学模型，揭示了β-淀粉样蛋白(Aβ)通过CD73-腺苷-A2AR轴选择性损伤海马长时程增强(LTP)的机制，为靶向腺苷能系统干预阿尔茨海默病(AD)的早期突触功能障碍提供了新的实验依据和药物筛选平台。
β-淀粉样蛋白(Aβ)被认为是阿尔茨海默病(AD)的主要致病因素之一，它导致突触功能障碍和记忆缺陷。尽管AD动物模型的研究一致显示突触可塑性（主要是长时程增强(LTP)）的改变，但Aβ影响突触功能的具体机制尚未阐明。本研究旨在优化一种新的体外模型，以研究Aβ对突触可塑性的直接影响，并阐明其背后的分子机制。
研究使用8-12周龄的C57BL/6J小鼠，以及全局A2AR敲除(gA2ARKO)、前脑神经元选择性A2AR敲除(fbA2ARKO)和CD73敲除(CD73KO)小鼠及其对应野生型(WT)对照。通过立体定位手术向小鼠侧脑室单次注射2 nmol Aβ1-42或溶剂（水）来模拟早期AD模型。离体实验中，制备小鼠海马切片，并在人工脑脊液(ACSF)中孵育。通过细胞外记录技术，在CA1区辐射层记录Schaffer侧支-CA1锥体神经元突触的场兴奋性突触后电位(fEPSP)，以评估基础突触传递、配对脉冲易化(PPF)和由高频刺激(HFS)诱导的LTP。使用的药物包括咖啡因、腺苷脱氨酶(ADA)、选择性A1R拮抗剂DPCPX、选择性A2AR拮抗剂SCH58261以及CD73抑制剂α,β-亚甲基ADP(AOPCP)。统计数据以均值±标准误表示，采用t检验或方差分析(ANOVA)进行显著性检验。
首先，我们建立了Aβ触发海马代表性神经回路神经生理学改变的体外模型。研究发现，50 nM的Aβ暴露40分钟不会改变基础突触传递，但会显著降低LTP的幅度。更高浓度(200 nM和500 nM)的Aβ则会同时降低基础突触传递和LTP。由于50 nM Aβ能选择性抑制LTP而不影响基础传递，因此被选作建立早期AD体外神经生理学模型的浓度。该浓度下，Aβ降低了PPF（短期可塑性的指标），并显著抑制了LTP的幅度。值得注意的是，这种体外急性Aβ暴露对LTP的抑制效果，与体内侧脑室注射Aβ 14天后的海马切片观察到的LTP抑制效果一致，尽管体内模型未观察到PPF的改变。这表明确立的体外模型能有效模拟体内Aβ暴露对海马LTP的关键影响。
1–42对基础突触传递和长时程增强(LTP)的影响。A, B显示200 nM和500 nM Aβ降低基础传递，50 nM则无影响。C, D显示所有测试浓度Aβ均相似程度地降低LTP幅度。">
1–42体外和体内暴露对海马LTP的影响比较。体外应用Aβ (50 nM)不改变输入-输出曲线(A)，但损害PPF (B)和LTP (C, D)。体内注射Aβ同样损害LTP (F, G)，但不影响PPF (E)。">
为评估Aβ对突触可塑性的影响是否依赖于腺苷介导的神经调控，我们在海马切片中灌注了腺苷脱氨酶(ADA)，它能将细胞外腺苷转化为无活性的肌苷。结果发现，ADA本身会降低PPF和LTP幅度，并且完全阻断了Aβ对PPF和LTP的影响。同样，非选择性腺苷受体拮抗剂咖啡因(50 μM)也能逆转Aβ对PPF和LTP的损害作用。这些结果表明，细胞外腺苷信号对于Aβ损害海马切片LTP的能力至关重要。
Aβ诱导的PPF损伤涉及A1R，而LTP损伤涉及A2AR
为明确腺苷受体的具体作用，我们研究了主要脑内腺苷受体A1R和A2AR的贡献。选择性A1R拮抗剂DPCPX (100 nM)损害了PPF，但不影响LTP。DPCPX阻断了Aβ对PPF的影响，但未能阻止Aβ对LTP的抑制。相反，选择性A2AR拮抗剂SCH58261 (50 nM)不影响PPF，但能降低LTP幅度并逆转Aβ对LTP的抑制。在体内注射Aβ的模型中也观察到，SCH58261同样可以逆转Aβ导致的LTP损伤。这证实了Aβ对海马LTP的损害主要通过A2AR介导。
1R和A2AR发生。DPCPX阻断了Aβ对PPF的影响(A)，但不影响Aβ对LTP的抑制(B, C)。SCH58261逆转了Aβ对LTP的抑制(E, F)，无论是体外急性暴露还是体内注射模型(G, H)。">
为确认A2AR的作用，我们使用了A2AR基因敲除小鼠。在全局A2AR敲除(gA2ARKO)小鼠的海马切片中，Aβ未能改变LTP幅度，而在野生型(WT)小鼠中则显著抑制LTP。为进一步确定神经元A2AR的特异性作用，我们测试了前脑神经元选择性A2AR敲除(fbA2ARKO)小鼠。结果表明，Aβ能降低WT对照切片的LTP幅度，但在fbA2ARKO小鼠的切片中，Aβ不再影响LTP。这些观察结果证实了神经元A2AR在Aβ诱导的海马LTP抑制中起着不可或缺的作用。
2AR。Aβ降低了WT小鼠的LTP，但对gA2ARKO (A, B)或fbA2ARKO (C, D)小鼠的LTP无影响。">
CD73介导的细胞外腺苷生成对Aβ诱导的LTP抑制至关重要
由于A2AR对LTP的调控依赖于CD73介导的细胞外腺苷生成，我们测试了CD73的药理抑制和基因消除对Aβ诱导LTP抑制的影响。CD73抑制剂AOPCP (100 μM)能降低LTP幅度，并逆转Aβ对LTP的抑制。在体内注射Aβ的模型切片中，AOPCP同样能逆转Aβ对LTP的影响。此外，在CD73KO小鼠的海马切片中，Aβ的急性应用未能改变LTP幅度，而在WT小鼠中则显著抑制LTP。这表明CD73介导的细胞外腺苷生成是Aβ损害海马LTP的关键环节。
本研究建立了一种Aβ急性暴露选择性改变海马LTP的体外模型，该模型模拟了体内侧脑室注射Aβ作为早期AD小鼠模型的影响。该模型具有卓越的实验可重复性、机制解析度和转化筛选潜力，可用于识别控制Aβ诱导LTP损伤的药物。模型的利用使我们证实，Aβ诱导的LTP损伤是通过神经元腺苷A2A受体(A2AR)的选择性过度功能，经由CD73介导的细胞外腺苷生成而发生的机制。
大量研究表明，不同AD动物模型中的突触可塑性（主要是LTP）均受到影响。我们的数据表明，Aβ并未引发明显的突触毒性（这会抑制所有突触活动），而是选择性地改变了突触适应性。Aβ在未改变海马谷氨酸能突触基础传递的情况下，持续改变了LTP幅度，这意味着Aβ可能影响的是在可塑性过程中选择性参与的特定机制，而非基本的兴奋性神经传递机制。
Aβ可以通过多种途径影响突触功能，包括直接影响线粒体、谷氨酸受体（如NMDA受体）以及参与突触适应和沉默的不同转导通路。此外，Aβ还可通过非突触靶点间接影响突触功能，例如抑制星形胶质细胞介导的谷氨酸摄取、引发小胶质细胞相关的神经炎症、影响中间神经元功能以及改变类淋巴和血管功能。本研究发现，腺苷A2A受体(A2AR)的过度激活在Aβ诱导的海马LTP抑制中起关键作用。清除细胞外腺苷（阻止ATP衍生的细胞外腺苷形成）或对A2AR进行药理学或遗传学阻断，均足以消除Aβ抑制海马LTP的能力。值得注意的是，A2AR已被公认能选择性调控海马LTP，而不影响基础突触传递或短期可塑性。这涉及一个突触自洽机制：随着刺激强度增加，突触释放ATP增加，一系列外切核苷酸酶将细胞外ATP转化为腺苷，导致这些突触中A2AR的过度激活。这一情景与神经元A2AR在控制记忆衰退中的核心功能完全一致，强化了Aβ抑制海马可塑性主要是一种突触自洽现象的观点。
近年来，越来越多的证据指出腺苷信号在多种脑部疾病中具有关键的神经保护作用，包括AD的发病机制。腺苷和A2AR参与Aβ直接暴露导致的LTP失衡是明显的，无论是通过拮抗剂SCH58261阻断受体，还是通过全局A2AR敲除小鼠进行基因消除。同样，在AD的体内模型中，抑制A2AR功能也能预防突触可塑性缺陷，这与记忆损伤的逆转相关。这些发现与报道的咖啡及其主要活性成分咖啡因（在规律、适量摄入时，其主要作为脑内腺苷受体拮抗剂）对减轻AD记忆衰退的预防性益处显著一致。此外，动物研究揭示，A2AR的过度功能既是触发记忆损伤的必要条件，也是充分条件。总体而言，证据表明A2AR的过度功能是干预AD的一个新靶点。
AD中A2AR的过度功能被认为源于患病脑区（特别是突触内，也包括星形胶质细胞）A2AR密度的增加，尽管记忆功能障碍很大程度上归因于神经元A2AR的失调。本研究进一步支持了我们之前的观点，即A2AR的过度功能还源于通过CD73/外切-5′-核苷酸酶将ATP分解为腺苷的细胞外分解代谢增加。我们之前观察到，在早期AD模型中，CD73的基因消除会产生积极结果，在恐惧记忆控制中也描述了类似效应。值得注意的是，我们在神经生理学模型中获得的现有数据与之前的观察结果一致，表明Aβ诱导的LTP改变涉及嘌呤能系统一个整合轴的功能失调，包括ATP释放增加、CD73介导的细胞外腺苷生成增加以及神经元A2AR的过度功能。这一结论促使进一步研究以探讨Aβ对神经末梢ATP释放的影响，并测试控制这种“危险信号”机制加剧是否是抵消Aβ对LTP负面影响的可行替代方案。
总之，我们的结果表明，在小鼠海马切片中急性施用Aβ会抑制LTP，模拟了AD的体内模型，其机制涉及CD73-腺苷-A2AR轴的过度功能，这与之前在AD体内模型中得出的结论一致。这种新型神经生理学模型提供了一种简化而稳健的方法，在时间和成本上具有显著优势，可用于筛选和选择控制Aβ对海马LTP影响的新药，作为管理AD的候选新药。
