胶质母细胞瘤中巨噬细胞极化的分子决定因素及其在肿瘤进展中的作用

《Cells》：Molecular Determinants of Macrophage Polarization in Glioblastoma and Implications for Tumor Progression Xiao-Xiao Luo, Min Fu, Ben Zhao, Feng Yang, Yi-Zhou Liu, Xiao-Hong Peng, Shi-Yong Li, Gao-Feng Zhan, Ying-Jia Hu and Qian-Xia Li + 2 authors

这篇研究阐述了胶质母细胞瘤（GBM）如何通过其分泌的因子调控肿瘤相关巨噬细胞（TAM）向促进肿瘤的M2表型极化，并首次系统性地识别出CD74、CLEC7A和IFI30等关键基因在其中扮演的核心作用。研究结合了多组学数据分析与体外功能实验，揭示了巨噬细胞极化与患者不良预后的强关联，为通过靶向巨噬细胞重编程以改善GBM治疗的策略提供了新的分子靶点和实验依据。

　　

1. 引言

胶质母细胞瘤（GBM）是一种高度侵袭性的脑肿瘤，其复杂的肿瘤微环境（TME）在疾病进展中扮演着关键角色。肿瘤微环境中的免疫细胞，尤其是巨噬细胞，根据其极化状态，既能抑制也能促进肿瘤发生。巨噬细胞主要可分为促炎的M1表型和免疫抑制、促肿瘤的M2表型。在GBM微环境中，巨噬细胞可来源于中枢神经系统（CNS）固有的小胶质细胞或从外周循环募集的骨髓来源巨噬细胞（BMDM）。GBM细胞通过分泌多种细胞因子和可溶性因子，驱动巨噬细胞向M2表型极化，从而塑造一个有利于肿瘤生长和免疫逃逸的微环境。本研究旨在通过整合多组学数据与实验验证，探究巨噬细胞极化在GBM中的作用及其分子机制。

2. 数据与方法

研究首先从癌症基因组图谱（TCGA）和数字空间分析（DSP）数据集获取了GBM患者的基因表达与临床信息。通过免疫浸润分析（使用CIBERSORT算法）和生存分析，筛选出与巨噬细胞浸润及患者预后相关的基因。利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据对候选基因在细胞水平的表达进行验证。在功能实验方面，研究者使用人GBM细胞系（U251和U87）的条件培养基（CM）处理由THP-1和U937单核细胞系诱导的M0巨噬细胞，通过实时定量PCR（RT-qPCR）、蛋白质印迹（Western Blot）、免疫荧光和流式细胞术等方法评估巨噬细胞的极化状态。此外，还通过质粒转染技术，在巨噬细胞中过表达了候选基因CD74、CLEC7A和IFI30，并利用Transwell侵袭实验和TUNEL凋亡检测评估了这些基因过表达的巨噬细胞对GBM细胞侵袭能力和凋亡的影响。

3. 结果

3.1. TCGA-GBM数据分析

对166个TCGA-GBM样本的分析显示，巨噬细胞（特别是M2亚型）的浸润水平与患者的不良预后显著相关。通过相关性分析和单变量Cox回归，研究者共鉴定出827个与巨噬细胞相关的基因，其中44个基因同时与巨噬细胞浸润和患者生存显著相关，包括41个风险基因和3个保护基因。

3.2. DSP数据集分析

对18例高级别胶质瘤患者的DSP数据分析发现，在CD68⁺巨噬细胞富集区域与GFAP⁺对照区域之间，存在378个差异表达基因，其中SPP1、CD74、C3等免疫相关基因在巨噬细胞中显著上调。这些差异表达基因与TCGA中筛选出的巨噬细胞/预后相关基因集取交集，最终得到10个候选基因用于后续分析。

3.3. 单细胞RNA测序数据验证

利用来自五个GBM患者样本的单细胞RNA测序数据，研究者进行了严格的质量控制和细胞类型注释。结果显示，在筛选出的10个候选基因中，有9个（ARHGAP4、CALHM6、CD68、CD74、CLEC7A、CSTA、IFI30、LRRC25、THEMIS2）在巨噬细胞群体中特异性高表达，确认了它们在肿瘤免疫微环境中的生物学相关性。

3.4. 靶基因在多个数据集中的交叉验证

在DSP和TCGA数据集中进一步验证了这9个基因。在DSP数据中，与GFAP⁺区域相比，所有9个基因在CD68⁺巨噬细胞富集区域均一致上调。在TCGA数据中，生存分析证实这些基因的高表达均与患者总生存期缩短显著相关，支持它们作为风险相关的预后生物标志物。

3.5. 条件培养基诱导的巨噬细胞极化

用U251、U87来源的条件培养基处理巨噬细胞后，RT-qPCR结果显示M1相关标志物（IL-1β、CD86、IL-6）的表达显著下调，而M2相关标志物（CD206、Arg1、CD163）以及免疫调节基因CD74、CLEC7A、IFI30的表达则显著上调。正常人类星形胶质细胞（NHA）的条件培养基则无此效应。蛋白质印迹和免疫荧光实验进一步在蛋白水平证实了CD74、CLEC7A和IFI30在GBM条件培养基处理的巨噬细胞中表达上调。

3.6. CD74、CLEC7A和IFI30的过表达促进M2极化

在巨噬细胞中分别过表达CD74、CLEC7A或IFI30后，RT-qPCR分析显示M1相关基因表达下降，而M2相关基因表达显著上升。流式细胞术分析进一步表明，过表达这些基因的巨噬细胞中CD11b⁺CD163⁺双阳性细胞的比例显著增加。这些结果为CD74、CLEC7A和IFI30直接驱动巨噬细胞向M2表型极化提供了有力证据。

3.7. 过表达巨噬细胞增强GBM恶性进展

共培养实验评估了过表达CD74、CLEC7A或IFI30的巨噬细胞对GBM细胞行为的影响。Transwell侵袭实验显示，与这些基因过表达的巨噬细胞共培养后，U251和U87胶质瘤细胞的侵袭能力显著增强。同时，TUNEL凋亡检测表明，共培养后胶质瘤细胞的凋亡率显著降低。这些发现表明，富含CD74、CLEC7A或IFI30的巨噬细胞不仅自身发生M2极化，还促进了肿瘤的侵袭和存活。

4. 讨论

本研究通过多数据集分析和实验验证，深入探讨了巨噬细胞极化与GBM进展的关系。研究发现，GBM细胞通过分泌可溶性因子诱导巨噬细胞向免疫抑制的M2表型极化，而CD74、CLEC7A和IFI30是这一过程中的关键下游效应分子。这些基因的过表达不仅足以驱动M2极化，还能增强巨噬细胞对肿瘤细胞的促侵袭和抗凋亡作用。这些结果为理解GBM中肿瘤细胞与免疫微环境的互作提供了新的分子见解。靶向这些巨噬细胞相关基因或它们介导的极化通路，有望成为重塑肿瘤微环境、抑制GBM进展的新治疗策略。未来的研究需要进一步区分小胶质细胞和骨髓来源巨噬细胞在此轴中的作用，并探索其作为精准治疗靶点的潜力。