《Nutrients》：Effect of Alpha-Lipoic Acid, Betaine, and L-Carnitine Supplementation on Gut Microbiota and Obesity Biomarkers in Mice
Hye-Jin Kim,
Jongbin Park,
Soomin Oh,
Dongwook Kim,
Hee-Jin Kim,
Cheorun Jo,
Eun Bae Kim and
Aera Jang
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本综述性研究探讨了三种代谢性补充剂（α-硫辛酸(AL)、甜菜碱(BT)和L-肉碱(LC)）对高脂饮食(HFD)诱导的肥胖小鼠模型中肠道菌群的影响。研究发现，三种补充剂均能调节肠道菌群结构，其中LC的调节作用最为显著，能降低厚壁菌门/拟杆菌门(F/B)比值，减少Christensenellaceae、Lachnospiraceae和Coprococcus 3等与肥胖相关的菌属，并伴随血清瘦素(leptin)、血脂等代谢指标的改善。这些微生物变化与宿主代谢、肥胖相关生物标志物存在关联，为进一步理解膳食补充剂调控肠道微生物、改善代谢健康提供了新见解。
引言
肥胖作为一种复杂的慢性代谢性疾病，其特征是脂肪过度积累并损害代谢健康。世界卫生组织数据显示，2022年全球约43.5%的成年人体重超标，15.8%为肥胖。肥胖的发生不仅与能量正平衡有关，还受到遗传、内分泌、环境和行为等多重因素影响。近年来，肠道菌群在肥胖和代谢综合征发展中的作用日益受到关注。肠道中数以万亿计的微生物影响着宿主的能量稳态、营养代谢和免疫调节。饮食模式极大地塑造了微生物的组成与功能，而菌群失调与代谢功能障碍密切相关。通过调节肠道通透性、炎症介质和宿主能量代谢，肠道菌群可能在肥胖相关代谢紊乱中扮演重要角色。因此，调控肠道菌群已成为改善代谢健康的潜在策略。
除了传统的饮食控制和药物外，基于天然来源生物活性化合物的膳食干预因其相对良好的安全性，被视为管理肥胖和代谢疾病的替代疗法。α-硫辛酸(AL)、甜菜碱(BT)和L-肉碱(LC)是三种代谢功能各异的生物活性化合物，分别参与氧化还原调节、一碳代谢和线粒体脂肪酸转运。已有研究报道它们在肥胖模型中可以改善代谢参数。我们前期的研究表明，在HFD诱导的肥胖小鼠中，以300 mg/kg BW/天的剂量补充AL、BT和LC 9周，可显著降低血清瘦素、甘油三酯、总胆固醇、肝脏脂质以及附睾脂肪组织的大小。然而，这三种补充剂的抗肥胖效应与肠道菌群调节之间的关系仍不清楚。这三种化合物在生化功能上存在显著差异：AL主要作为氧化还原活性辅因子，参与线粒体酶复合物和细胞抗氧化防御；BT作为甲基供体和渗透压保护剂，参与一碳代谢和脂质稳态；LC则通过促进长链脂肪酸穿过线粒体膜来参与线粒体脂肪酸转运。这些不同的代谢功能暗示，除了对肥胖和脂质代谢的系统性影响外，在高脂饮食条件下，每种化合物可能对肠道微生物生态产生不同的影响。本研究旨在比较评估这三种代谢特性不同的补充剂所诱导的菌群调节模式，并探讨其与肥胖相关代谢和脂肪指标之间的关联，而非确定单一优势化合物。
材料与方法
本研究使用4周龄雄性C57BL/6J小鼠，将其随机分为五组（n=6/组）：对照组（CON，10%脂肪）、高脂饮食组（HFD，60%脂肪）、以及HFD分别补充AL、BT或LC（300 mg/kg BW/天）组。补充剂通过灌胃给药，持续9周。实验结束后，收集粪便样本，并使用Maxwell? RSC PureFood GMO and Authentication Kit提取总细菌基因组DNA。通过扩增细菌16S rRNA基因的V3–V4区，在Illumina MiSeq平台上进行测序。使用QIIME 2进行微生物群落分析，并使用SILVA 132数据库进行物种分类。利用PICRUSt（通过重建未观察状态进行群落系统发育调查）工具，基于京都基因与基因组百科全书(KEGG)直系同源分类，推断宏基因组的代谢功能。为研究菌群-宿主代谢关联，对分类单元相对丰度与肥胖相关代谢标志物（来自先前相同实验队列的研究数据，包括血清瘦素、甘油三酯、总胆固醇、肝脏脂质含量和附睾脂肪组织重量）进行皮尔逊相关性分析。
结果
1. 微生物多样性
α多样性分析（包括观测到的OTU、Chao1、Shannon和Simpson指数）显示，高脂饮食组(HFD)的Chao1和Shannon值有低于对照组的趋势，但差异不具统计学意义。补充AL、BT和LC在观测到的OTU、Chao1和Simpson指数上未显示出显著差异。然而，HFD-LC组的Shannon指数相对于对照组显著降低。
在β多样性方面，基于主坐标分析(PCoA)发现，所有HFD喂养组与CON组在非加权UniFrac距离上存在显著差异。在加权UniFrac距离上，各组样本表现出较高相似性。在Bray–Curtis距离分析中，HFD喂养组与CON组可明显区分，而HFD-LC组与HFD组也显示出显著差异，表明LC补充对微生物群落结构产生了特定影响。
2. 肠道细菌组成
在门水平上，各组的肠道微生物主要由拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)组成。与CON组相比，HFD组表现出拟杆菌门减少、厚壁菌门增加的趋势。值得注意的是，HFD-LC组相对于HFD组，厚壁菌门显著下调，拟杆菌门显著上调，使其组成更接近CON组。厚壁菌门与拟杆菌门的比值(F/B)在HFD组为1.52，是CON组（0.76）的两倍，而HFD-LC组的F/B比值相对于HFD组显著降低。
在属水平上，HFD组中多个与饮食诱导肥胖相关的菌属丰度增加，包括Christensenellaceae、Lachnospiraceae、Blautia、Coprococcus 3、Lachnoclostridium和Erysipelotrichaceae。而HFD-LC组则显示Christensenellaceae、Lachnospiraceae、Blauita、Coprococcus 3、Lachnoclostridium和Erysipelotrichaceae的丰度降低，类似于CON组。此外，HFD-LC组中Bacteroides、Alloprevotella和Parabacteroides的丰度相对于HFD组有所增加。Epsilonbacteraeota门下的Helicobacter在HFD组有下降趋势，但在HFD-LC组中增加。比较各补充剂组，HFD-BT和HFD-LC组的Alloprevotella、Parabacteroides和Helicobacter均高于HFD组。HFD-LC组还显著增加了Bacteroides、Erysipelatoclostridium、Parasutterella和Butyricicoccus。而Erysipelotrichaceae在三个补充剂组中均减少，Lachnospiraceae在HFD-BT和HFD-LC组中减少。
3. 预测的KEGG功能分析
基于PICRUSt的预测功能分析揭示了各组间121个KEGG通路类别存在显著差异。其中，CON、HFD、HFD-AL、HFD-BT和HFD-LC组分别有39、47、3、4和28条通路显著上调。HFD-LC组富集的通路涉及TCA循环、L-缬氨酸和L-组氨酸降解，这表明LC补充可能与预测的代谢通路谱的改变有关。
4. 肥胖相关代谢标志物与肠道菌群的相关性
皮尔逊相关分析揭示了特定菌属与代谢/肥胖参数之间的关联。Faecalibaculum、Romboutsia、Ruminiclostridium、Clostridium sensu stricto、Muribaculaceae、Clostridiales vadin BB60 group、Anaeroplasma、Ruminococcus、Bifidobacterium、Muribaculum和Muribaculaceae与最终体重、瘦素、血清总胆固醇(TC)、血清低密度脂蛋白(LDL)、肝脏甘油三酯(TG)和附睾脂肪大小呈负相关。血清TG与Alloprevotella、Parabacteroides和Bacteroides呈负相关。
相反，Coprococcus 3、Lactococcus和Christensenellaceae与最终体重、瘦素、血清TC、肝脏TC和TG水平以及附睾脂肪组织大小呈正相关。Erysipelotrichaceae和Lachnospiraceae的增加与瘦素、血清LDL、肝脏TC水平和附睾脂肪大小的增加相关。高密度脂蛋白(HDL)通常与抗肥胖活性相关，本研究中Faecalibaculum、Romboutsia等多个菌属与肝脏HDL呈正相关。
HFD-LC组降低了与肥胖指标呈正相关的Christensenellaceae、Lachnospiraceae和Coprococcus 3，同时增加了与血清TG呈负相关的Bacteroides、Alloprevotella和Helicobacter。这些关联模式支持了微生物组成变化与代谢表型之间的生物学联系。
讨论
本研究利用16S rRNA基因测序探究了AL、BT和LC补充对HFD喂养小鼠肠道菌群组成的影响。HFD喂养与α多样性降低趋势相关，这与先前报道一致。LC补充与Shannon多样性降低相关，但多样性变化本身不一定反映功能健康状态，特定组成性转变可能更具相关性。
β多样性分析显示HFD喂养组与对照组明显分离，表明高脂饮食重塑了整体微生物群落结构。在补充剂中，LC在Bray–Curtis距离上与HFD表现出更大的差异，提示化合物对群落组成的特异性调节。
在门水平上，厚壁菌门和拟杆菌门占主导地位。HFD倾向于增加厚壁菌门并减少拟杆菌门，而LC补充则与F/B比值的部分恢复相关。尽管F/B比值曾被提出作为肥胖的标志，但其生物学意义仍存争议，应被视为更广泛组成变化的一部分。
在更精细的分类水平上，补充剂特异性模式更加明显。HFD-LC组减少了Christensenellaceae、Lachnospiraceae和Coprococcus 3等与肥胖相关的分类单元，同时增加了Bacteroides和Alloprevotella。BT补充也降低了Lachnospiraceae的丰度。AL和BT组均减少了Erysipelotrichaceae。关于Helicobacter在LC组中的增加，需谨慎解读，因为该属包含可能在鼠类模型中作为条件致病菌的物种。
预测功能谱分析显示，HFD喂养与包括支链氨基酸代谢在内的氨基酸生物合成通路富集相关。LC补充则与中心碳代谢和氨基酸降解相关通路的相对富集相关。需注意的是，这些功能谱是通过PICRUSt从16S rRNA基因数据推断得出的，代表的是预测的代谢潜力，而非直接的宏基因组测量结果。
相关性分析证明了特定菌属与代谢/肥胖参数之间的关联。在LC组中富集的菌属，如Bacteroides和Alloprevotella，与血清甘油三酯水平呈负相关。然而，肠道菌群与肥胖的关系是双向的，并受到宿主代谢、饮食暴露和微生物相互作用的共同塑造。因此，这些相关性不应被解释为补充剂改善代谢的因果机制证据。
本研究存在一些局限性。首先，这是在饮食诱导的肥胖模型中使用雄性C57BL/6J小鼠进行的探索性研究，样本量较小。其次，微生物群分析使用16S rRNA基因测序，功能通路分析基于PICRUSt推断，代表预测潜力。第三，分类学分配使用了SILVA 132数据库，属水平的分类分辨率可能因数据库版本而异。最后，补充剂量基于先前的小鼠研究设定。因此，观察到的菌群调节与代谢/肥胖指标之间的关联，应在此实验性和探索性框架内进行解读。
结论
补充AL、BT和LC与HFD喂养小鼠肠道菌群组成的差异性改变相关。本研究表明，LC补充与特定微生物分类单元和群落结构更显著的改变相关。HFD-LC组表现出降低的F/B比值和改变的微生物组成。观察到的Christensenellaceae、Lachnospiraceae和Coprococcus 3的减少，以及Bacteroides、Alloprevotella和Helicobacter的增加，与代谢和肥胖相关参数的表型指标存在相关性。在三种化合物中，LC显示出更显著的、与代谢和肥胖相关参数变化相平行的菌群关联性变化。然而，这些发现反映了实验模型内的关联性关系，并未建立因果机制。总体而言，本研究突出了微生物群对不同代谢特性膳食补充剂的差异性反应，为未来的机制性和转化性研究提供了基础。
