评估无糖口香糖递送凝结芽孢杆菌对牙菌斑微生物生态影响的随机对照研究

《Nutrients》：Assessing the Impact of Heyndrickxia coagulans Administered Through Sugar-Free Chewing Gum on Dental Biofilm: A Double-Blind Randomized Controlled Trial Silvia Cirio, Giacomo Mantegazza, Claudia Salerno, Simone Guglielmetti, Aesha Allam, Guglielmo Campus and Maria Grazia Cagetti

本文评估了通过无糖口香糖递送益生菌株Heyndrickxia coagulans（H. coagulans）对牙菌斑微生物群的调节作用。一项双盲随机对照试验（RCT）显示，该益生菌可被递送至牙菌斑，并在干预期间（T2）诱导α多样性（如Faith's PD、Pielou's evenness）的短暂改变，并广泛减少与口腔菌群失调相关的类群。然而，整体β多样性未显显著变化，且效果在干预停止后（T3）基本消失。研究表明，该递送方式具有潜力，但生态效应是轻微且可逆的，其临床意义需结合功能与临床指标进一步研究。

　　

1. 引言

口腔是一个复杂的微生态系统，其平衡被破坏与龋病、牙周病等口腔疾病相关。通过益生菌调节口腔微生物组已成为一种有前景的辅助策略。Heyndrickxia coagulans（曾用名Bacillus coagulans）是一种产乳酸的芽孢形成菌，前期研究提示其对口腔健康可能有益。口香糖作为一种递送基质，可延长益生菌在口腔内的滞留时间，增加与牙齿表面的接触。然而，关于益生菌通过口香糖递送后能否到达牙菌斑并调节其生态，证据仍然有限。本研究旨在通过一项随机、双盲、安慰剂对照试验，评估H. coagulans SNZ1969?对牙菌斑微生物组组成的生态影响。

2. 材料与方法

本研究在意大利米兰大学进行，时间为2024年9月至2025年4月。共招募52名健康成人志愿者，随机分为干预组（26人，接受含益生菌口香糖）和对照组（26人，接受安慰剂口香糖）。口香糖由Perfetti Van Melle S.p.A.生产，每片益生菌口香糖含有5 × 10⁸CFU的H. coagulans SNZ1969?。

研究共7周，包括2周洗脱期、4周干预期和1周干预后随访期。参与者在干预期每日咀嚼指定口香糖5次。分别在基线（T₀）、干预中期（T₁，2周）、干预结束（T₂，4周）和干预后1周（T₃）采集牙菌斑样本。

主要结局是牙菌斑微生物生态系统的表征，次要结局是通过qPCR在干预组样本中检测H. coagulans SNZ1969?。使用qPCR定量目标菌株，并通过针对16S rRNA基因V3-V4区的测序进行微生物群落分析。统计方法包括基于秩的“双重差分”模型、Wilcoxon和Mann-Whitney检验，以及基于负二项模型的差异丰度推断。

3. 结果

3.1. 样本特征

最终有44名受试者完成研究（干预组21人，对照组23人），脱落率为13.5%。两组在年龄、性别上无显著差异。部分参与者报告了胃肠道副作用（如腹胀），但组间无显著差异。

3.2. 牙菌斑样本中H. coagulans的检出情况

qPCR结果显示，在对照组T₀时点所有样本均为阴性。在干预组，益生菌检出率在T₁时为71.4%（15/21），在T₂时为61.9%（13/21）。干预期间阳性样本的中位载量为2.3-2.4 Log₁₀cells/ng。停止干预一周后（T₃），仅有9.5%（2/21）的受试者仍可检出，且载量较高。有5名受试者在整个干预期间均未检出。

3.3. 牙菌斑细菌群落结构分析：α多样性

在干预期间（T₀→ T₂），干预组与对照组在α多样性指标上显示出不同的轨迹。干预组的Faith系统发育多样性（Faith’s PD）中位值下降，而对照组上升，组间差异显著。同时，干预组的Pielou均匀度（Pielou’s evenness）显著增加，而对照组变化不大。然而，这些差异在经过错误发现率（FDR）校正后未达到显著性阈值（q < 0.05）。在观察到的特征数（Observed features）和香农熵（Shannon entropy）上未观察到组间差异。在T₃时点，所有α多样性指标的组间差异均消失。

3.4. 牙菌斑细菌群落结构分析：β多样性

基于加权/非加权UniFrac、Jaccard和Bray-Curtis距离的β多样性分析显示，在任何时间点（T₀, T₂, T₃），干预组与对照组的微生物群落整体结构均未发生显著分离。主坐标分析（PCoA）图中各点混杂，无清晰按时间聚类。ANOSIM分析也证实时间点间无显著差异。

3.5. 牙菌斑细菌群落结构分析：细菌类群

差异丰度分析揭示了干预组与对照组在类群水平上的不同轨迹。在干预结束时（T₂），干预组表现出广泛的类群丰度下降，涉及多个与口腔菌群失调相关的门和目，包括Pseudomonadota（如Burkholderiales, Pasteurellales）、Bacteroidota（如Flavobacteriales）、Bacillota（如Lactobacillales, Staphylococcales）、Actinobacteriota（如Micrococcales）以及Patescibacteria（如Saccharimonadales）。在属水平上，Rothia、Neisseria、Gemella、Streptococcaceae等的丰度降低，而Lachnoanaerobaculum的丰度增加。

在干预后一周（T₃），变化更为选择性，但仍持续观察到与牙周病相关的多个类群的丰度降低，包括Prevotella、Alloprevotella、Tannerella、Treponema、Leptotrichia、Kingella、Moraxella等。同时，未分类的Actinomycetaceae属（F0332）和Selenomonadaceae的丰度有所增加。

4. 讨论

qPCR数据表明，通过口香糖递送的H. coagulans SNZ1969?可以在大多数受试者的牙菌斑中检测到，但存在显著的个体差异，且停药后持久性有限（9.5%）。α多样性变化（Faith's PD下降、均匀度增加）提示益生菌干预可能通过选择性竞争或生态位替代，暂时性地重塑了群落结构，使其均匀化并降低了系统发育广度。然而，这些变化未通过多重检验校正，且停药后消失，表明效应是短暂且依赖于持续暴露的。

β多样性未显示显著变化，表明整体群落结构保持稳定，益生菌的作用可能主要体现在特定类群的精细调控，而非大规模的群落重构。差异丰度分析的结果支持这一点：干预导致了与炎症和牙周病相关的多种厌氧、蛋白水解类群（如Prevotella, Tannerella, Treponema）的广泛减少，同时伴有少数共生菌的有限增加。这种“有针对性且幅度适中”的生态重塑模式，与益生菌作为牙周治疗辅助手段的临床证据相符。

需要强调的是，本研究未评估临床口腔健康终点。因此，观察到的微生物组变化应解读为牙菌斑内的生态偏移，而非临床获益的直接证据。口香糖咀嚼本身增加的唾液流量和机械性菌斑干扰也可能产生影响，尽管安慰剂对照设计在一定程度上控制了此混杂因素。

5. 结论

本随机对照试验表明，通过无糖口香糖递送H. coagulans SNZ1969?可使该菌株在干预期间到达并累积于多数受试者的牙菌斑中，并诱导牙菌斑微生物组发生轻微、短暂的生态变化。这些变化包括干预期间α多样性的短暂改变，以及多种与口腔疾病相关类群的丰度降低。然而，这些效应在停止干预后基本逆转，且整体微生物群落结构（β多样性）保持稳定。由于样本量有限且缺乏临床终点，这些生态学发现需谨慎解读，并在未来更大规模、结合功能分析与临床评估的研究中进一步验证。