《International Journal of Molecular Sciences》：Morphofunctional State of the Liver Under Conditions of Three-Month Dark Deprivation: The Influence of Circadian Disruptions and Melatonin
David A. Areshidze,
Maria A. Kozlova,
Anna I. Anurkina and
Valeriy P. Chernikov
编辑推荐：
本研究探讨了三个月持续光照（暗剥夺）对年轻成年大鼠肝脏形态与功能的影响，并评估了外源性褪黑素的干预效果。研究发现，暗剥夺导致血浆褪黑素水平急剧下降，引发肝脏出现脂肪变性、细胞衰老标志物激活、昼夜节律基因表达紊乱及线粒体损伤等一系列加速衰老的病理改变。重要的是，补充褪黑素能完全预防这些异常，展现了其强大的肝脏保护和节律保护作用。本文为理解光污染相关的代谢疾病和抗衰老策略提供了多层次的实验证据。
引言：光污染、昼夜节律与肝脏健康
在现代城市环境中，持续的人造光照（“光污染”）已成为一个普遍现象。世界卫生组织已将夜班工作归类为可能的致癌因素。越来越多的证据表明，昼夜节律紊乱（去同步化）与肥胖、2型糖尿病、心血管疾病、神经退行性疾病以及机体加速衰老密切相关。肝脏作为一个代谢核心器官，其高达80%-90%的代谢相关基因表达受昼夜节律调控，因此对节律紊乱特别敏感。
哺乳动物的昼夜节律系统是一个层级结构。位于下丘脑视交叉上核（SCN）的中枢起搏器通过视网膜下丘脑束接收光信号。外周振荡器则存在于包括肝细胞在内的几乎所有体细胞中。在分子层面，昼夜节律钟的功能由自主的转录-翻译反馈环路维持。转录因子BMAL1（ARNTL）和CLOCK的异二聚体与Period（Per）和Cryptochrome（Cry）基因启动子上的E-box元件结合，激活其表达。PER和CRY蛋白在细胞质中积累并形成复合物，转运至细胞核后抑制BMAL1/CLOCK的活性，从而抑制自身的转录。褪黑素是连接光信号与内分泌输出的关键分子。在黑暗中，松果体细胞内的芳烷基胺N-乙酰转移酶（AANAT）被激活，将血清素转化为N-乙酰血清素，进而代谢为褪黑素。光照会抑制AANAT活性，导致激素水平急剧下降。
本研究旨在全面评估三个月持续光照（暗剥夺）对年轻成年大鼠肝脏形态功能、超微结构和分子状态的影响，并探究外源性褪黑素的纠正作用。实验假设长期暗剥夺会通过褪黑素缺乏，诱导肝脏出现符合加速衰老标准的复合性改变，而外源性褪黑素能够阻断这一病理级联反应。
结果
1. 褪黑素水平与生化参数
三个月暗剥夺导致血浆褪黑素水平被深度抑制：暗剥夺组（DD）的浓度（15.18 ± 3.27 pg/mL）比对照组（77.29 ± 8.59 pg/mL）低了5倍以上。补充褪黑素组（DD + Mel）的激素水平（65.58 ± 11.90 pg/mL）则与对照组无差异。
生化分析显示，DD组大鼠出现了一系列代谢紊乱：血糖降低（低血糖）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）活性升高（细胞溶解标志物）、总蛋白和白蛋白浓度显著降低（低蛋白血症和低白蛋白血症），以及胆固醇和甘油三酯水平升高。乳酸脱氢酶（LDH）和碱性磷酸酶（ALP）活性也升高。补充褪黑素后，所有这些生化参数均恢复正常，与对照组无统计学差异。
2. 肝脏形态与形态计量学
显微镜检查显示，对照组和DD + Mel组的肝脏结构正常，肝小叶结构完整，多角形肝细胞形成清晰的肝索。而DD组尽管器官整体结构保留，但仍观察到肝细胞的水样变性和微泡性脂肪变性，以及单个细胞坏死。
形态计量学分析揭示了显著变化：
- •
双核肝细胞比例在DD组显著低于对照组。
- •
肝细胞面积增加了18%，而细胞核面积不变，导致核质比（N/C比）下降30.4%，表明细胞肥大。
- •
结缔组织比例显著增加，提示纤维化发展。
- •
脂肪变性肝细胞比例和脂肪变性程度在DD组均显著高于对照组。
- •
在DD + Mel组，除了脂肪变性肝细胞比例略高于对照组外，上述所有形态学异常均被完全预防或显著改善。有趣的是，DD + Mel组的双核肝细胞比例甚至显著高于对照组和DD组。
3. 分子标志物表达
免疫组织化学分析显示，DD组的分子表达发生剧烈改变：
- •
细胞衰老标志物p16（增加24.2倍）和p21（增加6.8倍），以及应激相关蛋白p53（增加1.8倍）的表达急剧升高。
- •
关键的昼夜节律振荡器激活因子BMAL1和CLOCK的表达被深度抑制，而PER2的表达显著升高。
- •
增殖标志物Ki-67指数也显著增加，表明损伤引发的代偿性增生。
在DD + Mel组，所有研究的分子标志物（p16， p21， p53， BMAL1， CLOCK， PER2， Ki-67）的表达均与对照组无差异，表明褪黑素能完全使肝细胞的分子谱正常化。
4. 肝细胞的超微结构
对照组肝细胞的超微结构正常。电子显微镜检查显示，DD组出现了加速衰老的迹象：肝细胞内脂褐素色素积累、线粒体多形性肿胀伴嵴破坏、粗面内质网（RER）池扩张以及高尔基复合体减少。
线粒体形态计量学显示，与对照组相比，DD组线粒体的数值密度有下降趋势，线粒体嵴的数量显著减少。高尔基复合体的形态计量学分析也显示，DD组的所有研究参数（如扁平囊泡数量、轮廓面积）均呈下降趋势。在DD + Mel组，肝细胞的超微结构与对照组相当：可见圆形细胞核、基质致密的线粒体、发育良好的RER和众多高尔基复合体。
讨论
本研究全面描述了长期光照剥夺（持续光照三个月）条件下大鼠肝脏的结构和功能变化，并证明了外源性褪黑素具有显著的保护作用。数据显示，由内源性褪黑素分泌抑制引起的去同步化，在系统、组织、细胞和分子水平启动了一系列病理过程，其总和符合肝脏加速衰老的标准。
暗剥夺导致的生化指标改变，与当前对昼夜节律失调在代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）发病机制中作用的理解一致。AST、ALT和LDH活性升高是细胞膜损伤的标志，在超微结构水平上得到线粒体肿胀和嵴破坏的证实。褪黑素通过恢复脂质代谢的昼夜节律调节并发挥抗氧化特性，显著减轻了DD组的脂肪变性。
肝细胞面积增大伴随核质比下降，表明细胞肥大，这通常被视为对代谢应激的适应性反应，但也可能是病理性重塑和纤维化的前兆。结缔组织比例增加一倍证实了纤维化的发展。研究表明，褪黑素通过激活MT2受体，增加BMAL1和抗氧化酶的表达，从而抑制TGF-β1诱导的肝星状细胞（HSC）活化，发挥抗纤维化作用。
DD组双核肝细胞比例下降可能反映了胞质分裂过程受损或能够形成双核形式的细胞库耗竭，而这些细胞被认为是多倍体化和再生的储备。有趣的是，DD + Mel组的双核细胞比例不仅高于DD组，也高于对照组，这可能表明褪黑素作用下再生过程被激活，肝脏功能储备增加。
本研究最重要的结果是证明了慢性光照剥夺在肝脏中诱导了细胞衰老表型，表现为p16、p21和p53表达急剧增加。p16和p21是公认的衰老生物标志物，其在年轻组织中表达量极低。同时，DD组BMAL1和CLOCK的深度抑制证明了分子昼夜节律振荡器的解体。PER2表达增加可能是昼夜周期反馈机制破坏的结果。在DD + Mel组，所有分子标志物的完全正常化表明，外源性褪黑素不仅补偿了内源性激素的缺乏，还通过可能包括MT2-BMAL1轴和ROR-α活性调节在内的受体介导机制，恢复了控制衰老和昼夜节律性的调节回路。
电子显微镜数据为观察到的功能损伤提供了直接可视化证据。脂褐素（“衰老色素”）的积累是氧化应激和自噬效率降低的标志。年轻（6月龄）大鼠在光照剥夺下表现出与年龄相关的超微结构变化，证实了去同步化导致“加速衰老”的概念。线粒体损伤（多形性、肿胀、嵴破坏）证实了线粒体功能障碍在发病机制中的关键作用。褪黑素在细胞内线粒体中高浓度积累的能力及其直接的抗氧化活性，解释了其在DD + Mel组中对细胞器超微结构的保护作用。DD组高尔基复合体的减少（扁平囊泡数量和轮廓面积减少）与低白蛋白血症和肝脏分泌功能受损相关。褪黑素作用下高尔基复合体形态的恢复，强调了其在维持细胞能量和分泌装置方面的作用。
综合数据可提出以下事件序列：慢性光照暴露 → 褪黑素抑制 → 受体信号传导（MT2， ROR-α）破坏 → 肝细胞昼夜节律振荡器（BMAL1/CLOCK减少）解体 → 代谢失调（血脂异常、碳水化合物和蛋白质代谢紊乱） → 氧化应激和线粒体功能障碍 → 细胞衰老通路（p53/p21， p16）激活 → 肝细胞肥大和多倍体化 → 脂肪变性和纤维化（通过HSC激活） → 代偿性增殖（Ki-67增加）伴随再生储备耗尽（双核细胞比例减少）。
外源性褪黑素通过补充激素缺乏，在多个层面发挥作用：系统层面恢复昼夜节律信号和外周振荡器的同步；受体层面激活MT2-BMAL1-抗氧化通路并调节ROR-α活性；分子层面使生物钟基因表达正常化，抑制衰老通路（p53/p21， p16），并恢复线粒体蛋白（如Rab8a）的表达；细胞层面维持线粒体稳态和自噬，增加双核肝细胞库；组织层面预防脂肪变性和纤维化。
材料与方法
本研究使用90只3月龄雄性Wistar大鼠。动物被随机分为三组：对照组（C）保持固定光暗周期（12小时光照/12小时黑暗）；暗剥夺组（DD）接受持续光照（24小时/天）；暗剥夺+褪黑素组（DD + Mel）在持续光照的同时，通过饮用水补充褪黑素（剂量为12 mg/L），每周5次，持续三个月。实验结束时（动物年龄6个月），采集血液和肝脏样本进行分析。
分析方法包括：血浆褪黑素浓度测定（ELISA法）、标准生化指标检测、肝脏组织学（H&E和Masson三色染色）与形态计量学分析、关键分子标志物（p16， p21， p53， BMAL1， CLOCK， PER2， Ki-67）的免疫组织化学分析、以及肝细胞超微结构的电子显微镜检查和细胞器形态计量学。所有数据使用GraphPad Prism软件进行统计分析。
研究的局限性
本研究存在一些局限性：研究对象为年轻成年雄性大鼠，结果可能无法完全外推至雌性或老年动物；仅在一个时间点（实验结束）进行了检测，缺乏动态过程观察；褪黑素通过饮水给药，剂量为超生理剂量，且未能完美模拟内源性夜间高峰；虽然评估了关键的昼夜节律和衰老标志物，但未进行功能实验或基因操作来建立因果关系；未设置恢复组（即暗剥夺后恢复正常光照但不给予褪黑素）来评估无治疗情况下的可逆性。尽管如此，本研究仍为去同步化诱导的肝脏病理提供了全面的、多层次的特征描述，并证明了褪黑素强大的保护作用。
结论
本研究证实，长期光照剥夺（暗剥夺）通过抑制内源性褪黑素分泌，在年轻成年大鼠肝脏中诱导了复杂的、符合加速衰老标准的形态功能重塑和代谢功能障碍。这种损伤表现在生化紊乱、组织病理学改变（脂肪变性、纤维化）、细胞衰老标志物激活、核心昼夜节律基因表达抑制以及线粒体等细胞器超微结构损伤等多个层面。重要的是，补充外源性褪黑素能够完全预防所有这些异常，展现了其显著的肝脏保护和节律保护功效。这些发现不仅深化了对“光污染”作为肝脏加速衰老风险因素的理解，也为使用褪黑素预防和纠正与昼夜节律紊乱相关的肝脏疾病提供了坚实的实验依据，具有重要的公共卫生和临床转化意义。
