《International Journal of Molecular Sciences》：Structure and Substrate Specificity of Human Short-Chain Acyl-CoA Dehydrogenase and Insights into Pathogenicity of Disease-Associated Mutations
Fang Bai,
Xinru Li,
Kaide Ju,
Xijiang Pan,
Ye Jin,
Zhijing You,
Lili Zhang,
Zhaoxia Liu,
Shuyang Zhang and
Xiaodong Luan
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本综述深入探讨了人类短链酰基辅酶A脱氢酶（SCAD）的结构、底物特异性及其基因（ACADS）突变如何导致SCAD缺乏症（SCADD）。文章通过高分辨率冷冻电镜结构揭示底物结合机制，并系统地将致病突变分为三大功能类别。研究不仅阐明了酶活丧失机制，还发现了错误折叠突变（如W177R）会引发蛋白聚集、氧化应激与细胞凋亡，为理解SCADD的病理机制提供了新的结构框架与细胞学见解。
1. 引言
短链酰基辅酶A脱氢酶（SCAD）是线粒体脂肪酸β-氧化螺旋中的关键起始酶，负责催化短链酰基辅酶A的α, β-脱氢反应。SCAD属于酰基辅酶A脱氢酶（ACAD）家族，对四碳（丁酰辅酶A）和六碳（己酰辅酶A）链长的底物具有特异性，在细胞能量稳态和脂质代谢中扮演不可或缺的角色。ACADS基因突变会导致SCAD缺乏症（SCADD），这是一种临床异质性极高的常染色体隐性遗传代谢病，症状可从严重的新生儿代谢危象到轻微的发育迟缓、肌张力低下甚至无症状。尽管已有超过80种致病变异被报道，但大多数变异导致功能丧失和疾病谱的精确分子机制尚不清楚。此前的研究虽然解析了人源SCAD与辅酶A过硫化物结合的结构，但缺乏天然底物结合的信息，使得底物特异性及完整催化机制的确定仍存关键空白。因此，获取SCAD与短链酰基辅酶A底物结合的高分辨率结构对于阐明其酶活性和链长选择性的结构基础至关重要。
2.1. SCAD的整体结构
本研究利用单颗粒冷冻电镜（cryo-EM）技术，解析了人源SCAD与其生理底物丁酰辅酶A（C4）以及更长底物己酰辅酶A（C6）复合物的高分辨率结构。丁酰辅酶A结合结构的分辨率达到2.1 ?，揭示了SCAD以同源四聚体（二聚体的二聚体）形式存在。每个单体包含N端α螺旋结构域、中央β折叠结构域和C端α螺旋结构域。活性位点位于这三个结构域的界面处，同时容纳FAD辅因子和脂肪酰基辅酶A底物，这种结构为催化反应所需的底物精确定向提供了支持。
2.2. SCAD的FAD与底物结合口袋结构洞察
SCAD对丁酰辅酶A表现出最高的催化活性。2.1 ?分辨率的冷冻电镜结构清晰地解析了活性位点中非共价结合的FAD以及丁酰辅酶A分子的电子密度。催化残基Glu392被精确定位于FAD结合域和底物结合域的界面附近，紧邻底物的Cα–Cβ键，是负责α-质子抽提的催化碱基。FAD辅因子位于二聚体界面，其腺苷部分与功能二聚体中相邻亚基相互作用。底物结合口袋位于FAD的异咯嗪环对面，蛋白质残基与丁酰辅酶A之间观察到六个氢键作用。此外，由多个非极性残基构成的疏水隧道衬垫在底物结合腔周围，有助于脂肪链的最优定位。突变验证表明，E392A突变体几乎完全丧失了酶活性，证实了Glu392在催化中的关键作用。
D为1.25 μM。(C) SCAD–丁酰辅酶A复合物的单体结构，深入视图显示FAD结合位点、底物结合位点和活性位点（E392）的位置。(D) SCAD–丁酰辅酶A复合物结构中FAD与周围残基间的氢键相互作用。(E) 与丁酰基部分形成氢键相互作用的残基。(F) 构成丁酰辅酶A周围疏水口袋的特定氨基酸残基。">
2.3. SCAD底物选择性的结构基础
为了探究SCAD偏好短链酰基辅酶A的结构决定因素，研究还解析了SCAD与更长底物己酰辅酶A（C6）的复合物结构，分辨率为2.17 ?。表面等离子共振（SPR）结合亲和力测量显示，SCAD与己酰辅酶A的结合（KD= 92.8 μM）显著弱于与丁酰辅酶A的结合。结构分析表明，己酰辅酶A主要通过残基R272和D269形成氢键，极性相互作用数量少于丁酰辅酶A复合物。值得注意的是，己酰基部分呈现弯曲构象，因为S117、I275和Y391的侧链共同形成空间屏障，限制了更长酰基链的伸展。这种构象调整可能导致底物的Cα–Cβ键相对于催化碱基Glu392错位，破坏了催化所需的最优几何构型，从而降低了催化效率。对辛酰辅酶A（C8）的结合评估显示其亲和力更弱（KD= 200 μM），证实SCAD的活性位点在结构上受到限制，只能容纳较短的酰基链。
D为92.8 μM。(C) SCAD-己酰辅酶A复合物模型的不同视图。(D) SCAD–己酰辅酶A复合物的单体结构，深入视图显示SCAD与己酰辅酶A相互作用的细节。(E) SCAD-丁酰辅酶A（灰色）和SCAD-己酰辅酶A（绿色）复合物的结构叠加图，插图为底物结合口袋的近距离视图。">
2.4. 疾病相关突变的功能作用
为了阐明疾病相关突变的机制影响，研究将ClinVar数据库中已知的致病和罕见变异引入重组SCAD，并评估了它们对酶活性、结合亲和力和蛋白质稳定性的影响。根据结构和功能数据，SCAD的疾病相关突变可分为三大功能类别：(i) 破坏FAD结合或四聚体组装（如L154R， G160S， Q365H）；(ii) 损害底物结合和定位（如S161G， R272C， L400V）；(iii) 损害蛋白质折叠和稳定性，导致可溶性表达降低（如R46W， R383C， W177R）。其中，位于FAD结合域的L154R和G160S突变体酶活性严重受损；位于底物结合域的S161G、R272C和L400V等变异显著降低了对丁酰辅酶A的结合亲和力；而位于FAD或底物结合位点之外的一些突变（如W177R）则导致可溶性表达显著减少，表明其折叠和稳定性受损。
2.5. W177R突变在细胞中引发蛋白质错误折叠和聚集
为了验证折叠不稳定突变通过蛋白质聚集导致功能丧失的假说，研究选择了在重组形式中几乎无可溶性表达的W177R突变体，在293T细胞中进行了进一步的机制研究。酶活性测定显示，表达W177R的细胞其活性与空载体对照相当，表明存在严重的功能障碍。对细胞裂解物进行可溶性和不溶性组分分离分析发现，野生型SCAD在可溶部分显示出强烈的四聚体条带，而W177R的信号则显著减弱。SDS-PAGE分析进一步证实，W177R SCAD在可溶部分检测不到，但完全存在于不溶性沉淀中。这些数据表明，W177R突变破坏了正常的蛋白质折叠，阻止了四聚体形成，并促进了不溶性聚集物的形成，从而废除了酶功能。
2.6. 表达W177R突变体蛋白的细胞诱导氧化应激和凋亡
累积的错误折叠蛋白通常会对细胞产生毒性作用，引发氧化应激。对转染细胞线粒体超氧化物生成的评估显示，携带W177R突变的细胞中线粒体超氧化物水平显著升高，但细胞质活性氧（ROS）水平未见明显增加，表明W177R突变体蛋白可能通过激活细胞抗氧化系统来应对升高的线粒体ROS水平。正如预期，携带W177R的细胞中抗氧化酶超氧化物歧化酶（SOD）的活性上调，抗氧化酶基因TXNL-1和HO-1的表达也上调。鉴于持续的ROS高水平会损害细胞大分子并危及细胞活力，研究评估了细胞凋亡结果，确认W177R表达显著增加了细胞凋亡。这些发现支持了一个完整的致病级联反应：突变诱导的结构不稳定促进了蛋白质聚集，从而引发线粒体氧化应激，导致代偿性抗氧化激活并最终引发细胞凋亡。
+ PI+）情况。(F) TUNEL检测后表达WT或W177R的293T细胞代表性荧光图像，凋亡细胞由TUNEL染色（红色）指示，细胞核用DAPI（蓝色）复染。(G) 流式细胞术分析显示TUNEL阳性细胞群。">
3. 讨论
本研究整合了底物结合的SCAD冷冻电镜结构、全面的生物化学和细胞实验，阐明了SCAD功能与功能障碍的分子基础。结构分析揭示了SCAD活性位点相对较浅，其形状最适合容纳短链酰基。在丁酰辅酶A结合结构中，酰基部分结合在FAD异咯嗪环的re面附近，Glu392精确定位，有利于立体特异性地抽提pro-R α-氢并将氢负离子转移到FAD的N5原子上。相比之下，己酰辅酶A以弯曲构象结合，使可切割键远离Glu392，导致催化几何构型欠佳。这种结构扭曲是长链底物催化效率降低的基础。研究支持一个模型，即底物特异性不仅受结合口袋体积的调控，还受催化残基相对于底物的精确排列控制。
通过对19个疾病相关变异的系统表征，研究将它们分为三个功能类别，直接将分子损伤与生化结果联系起来，为解释SCADD中基因型-表型关系提供了基于结构的框架。严重破坏折叠或辅因子结合的突变可能导致严重的临床表现，而保留部分活性的低效等位基因可能表现为较轻或无症状的疾病。
超越酶功能的丧失，研究证明折叠缺陷突变可以主动赋予蛋白毒性。以W177R为例，突变体蛋白无法采用其天然四聚体状态，而是形成不溶性聚集体。这些聚集现象进而引发线粒体氧化应激。与此一致，观察到了包括TXNL-1和HO-1在内的抗氧化标志物的显著上调。重要的是，负责将超氧自由基转化为过氧化氢和氧气的关键线粒体酶SOD，其表达在线粒体氧化应激下被诱导，也显著升高。这一模式与先前在SCADD患者中观察到的抗氧化反应增强的临床发现相符。此外，研究证实W177R表达显著增加了细胞凋亡。这些发现共同支持了一个完整的致病级联反应：突变诱导的结构不稳定促进蛋白质聚集，进而触发线粒体氧化应激，导致代偿性抗氧化激活并最终引发细胞凋亡。
