《International Journal of Molecular Sciences》：Protective Effect of Gastrodia elata Polysaccharide GEP-2 Against Oxidative Stress in Intestinal Epithelial NCM460 Cells
Yongjiang Yao,
Xingjian Wen,
Xuefeng He,
Dan Liao,
Mengting Li,
Jiuyu Fan,
Rui Liang,
Xiaoqi Huang and
Na Li
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本研究首次系统揭示了天麻多糖成分GEP-2在肠道上皮细胞（NCM460）氧化应激模型中的保护作用与分子机制。通过体外实验证实GEP-2可显著提高细胞活力，抑制ROS（活性氧）和MDA（丙二醛）的生成，并维持线粒体膜电位（MMP）。结合转录组学与蛋白验证，阐明其通过协同激活Nrf2（核因子E2相关因子2）/NQO1抗氧化轴与JAK（Janus激酶）/STAT（信号转导与转录激活因子）生存信号通路，实现多靶点细胞保护，为开发新型肠道抗氧化剂提供了理论依据。
1. 引言
肠道不仅是营养消化吸收的主要场所，更是机体免疫防御系统的关键组成部分，能有效防止病原体和有害化合物的入侵。作为肠腔与内环境之间的主要接触层，肠道上皮细胞（IECs）不断暴露于各种物理和化学刺激，使其成为氧化应激高度敏感的目标。在正常情况下，细胞内活性氧（ROS）维持在适度水平，并参与调节关键的细胞信号转导通路。然而，一旦细胞的抗氧化能力不足以清除过量产生的ROS，将导致氧化还原系统失衡，引发脂质过氧化、蛋白质变性、DNA损伤等一系列病理变化。研究表明，在IECs中，慢性氧化应激可损害紧密连接结构的完整性，诱导线粒体功能障碍，并激活促炎信号级联反应，从而逐渐削弱上皮屏障功能。这些证据表明，氧化应激在肠道上皮结构损伤和黏膜微环境紊乱的机制中起着至关重要的作用。
合成抗氧化剂，如丁基羟基茴香醚（BHA）和丁基羟基甲苯（BHT），因其抗氧化功效已被广泛应用。但由于对其长期安全性的担忧，如潜在的肝肾毒性和遗传毒性风险，其广泛应用受到限制。研究人员一直在深入探索生物相容性更好的天然抗氧化成分。近年来，源自天然的活性化合物已成为功能食品和生物医学研究开发的重要热点。其中，源自中草药的多糖因其多样的化学结构、广泛的作用靶点和高临床应用安全性而备受关注。研究表明，这些多糖可有效清除自由基，激活细胞内的内源性抗氧化防御机制，并调节与细胞存活密切相关的信号通路，从而在缓解胃肠道氧化应激损伤中发挥显著的保护作用。
天麻作为一种成熟的传统药材，在神经系统疾病治疗中具有悠久的应用历史。近期的药理学研究表明，天麻多糖作为天麻的主要生物活性成分，具有多种生物学功能，包括显著的神经保护、免疫调节和抗氧化作用。我们先前的研究表明，天麻总多糖可有效缓解环磷酰胺（CTX）诱导的小鼠肠道黏膜损伤，减轻肠道组织的氧化应激损伤，调节肠道屏障功能，凸显了其在肠道保护中的潜在作用。氧化应激已被证实是CTX诱导细胞损伤的基本机制。过量的活性氧可直接损伤细胞大分子，最终导致细胞功能障碍或死亡。更普遍地，氧化应激被广泛认为是多种外源性损伤诱导肠道上皮损伤的核心介质。尽管天麻多糖的抗氧化特性已有记载，但其在氧化应激条件下对肠道上皮细胞内JAK/STAT（Janus激酶/信号转导与转录激活因子）信号通路的调节作用在很大程度上仍未得到探索。
基于前期的研究发现，本研究在NCM460细胞中建立了H2O2（过氧化氢）诱导的氧化应激模型，以研究天麻多糖-2（GEP-2）的保护作用及潜在机制。GEP-2是我们先前研究中从天麻中分离得到的一种水溶性低分子量多糖。为评估GEP-2的抗氧化特性，我们检测了细胞活力、线粒体膜电位（MMP）、细胞内ROS水平以及抗氧化参数，包括总抗氧化能力（T-AOC）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）活性、过氧化氢酶（CAT）活性和谷胱甘肽（GSH）含量。接着，进行转录组测序以识别响应GEP-2处理的差异表达基因。为确认关键信号通路，特别是与核因子E2相关因子2（Nrf2）、Janus激酶（JAK）和信号转导与转录激活因子3（STAT3）相关的通路的参与，进一步通过蛋白质印迹和逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）进行了验证。通过这种方法，本研究旨在阐明GEP-2如何缓解肠道氧化应激，为开发天麻作为天然肠道保护剂提供机制基础。
2. 结果
2.1. GEP-2显示出强大的体外抗氧化活性
如图1所示，通过DPPH和ABTS+两种体外测定法，对GEP-2与维生素C（VC）的抗氧化活性进行了比较评估。结果表明，GEP-2在两种体系中均表现出浓度依赖性的自由基清除能力。在所有测试浓度下，GEP-2的活性始终低于阳性对照VC。这些发现支持了GEP-2的体外抗氧化特性，为其作为天然抗氧化剂的潜在应用提供了基础。
?1 (n = 3). VC as a positive control. Values are expressed as mean ± SEM.">
2.2. GEP-2缓解H2O2诱导的NCM460细胞活力下降
2.2.1. H2O2诱导模型的建立
为建立稳定的体外氧化应激模型，本研究使用不同浓度（250–4000 μM）的H2O2处理NCM460细胞。在不同时间点（1–4 h）收集样本用于分析细胞活力。如图2A所示，H2O2的细胞毒性效应表现出浓度和时间依赖性。暴露于1000 μM H2O24 h导致细胞活力降至75.16%。此条件满足建模标准，因此被确定为后续实验中建立氧化应激损伤模型的最佳参数组。
2.2.2. GEP-2的安全性评估与实验浓度筛选
图2B表明，用浓度范围为25至400 μg·mL?1的GEP-2处理24小时未表现出细胞毒性。GEP-2显著增强了细胞活力。这些结果表明GEP-2在此浓度范围内具有良好的生物安全性。基于这些结果，选择50、100和200 μg·mL?1的浓度用于进一步分析。
2.2.3. GEP-2对H2O2诱导细胞毒性的保护功效
用GEP-2预处理显示出对抗H2O2诱导的细胞损伤的作用。结果表明，与正常组相比，用1000 μM H2O2处理显著降低了细胞活力。相反，用GEP-2预处理24小时的细胞显示出相对于模型组的活力呈浓度依赖性的显著增加。这证实了GEP-2预处理可有效缓解H2O2诱导的细胞活力下降，并对氧化应激损伤发挥明显的保护作用。
2.2.4. GEP-2抑制H2O2诱导的细胞内ROS过量产生
采用荧光探针DCFH-DA通过测量细胞内ROS水平来评估GEP-2的抗氧化能力。如图3A, C所示，与未暴露组相比，暴露组的绿色荧光强度显著增加，表明细胞内ROS积累。相反，用GEP-2预处理导致荧光强度明显降低。高剂量预处理组的荧光强度低于暴露组。这些结果表明，GEP-2可以抑制或遏制H2O2引发的ROS过度生成，从而缓解细胞内氧化应激并抑制NCM460细胞的氧化损伤。
2.2.5. GEP-2缓解H2O2诱导的NCM460细胞线粒体膜电位降低
活性氧（ROS）的过度积累会损害线粒体功能，导致线粒体膜电位（ΔΨm）下降，进而损伤线粒体功能。这是氧化应激诱导细胞损伤的关键因素。为了进一步研究GEP-2是否有助于在氧化应激条件下维持线粒体完整性，我们使用JC-1染色评估了ΔΨm的变化。结果如图3B, D所示。正常组细胞主要显示红色荧光并保持正常形态，表明线粒体功能完好。然而，模型组细胞显示红色荧光减少，绿色荧光增加。此外，观察到显著的形态学变化，包括细胞数量和大小减少，这与线粒体去极化和早期凋亡一致。GEP-2预处理改善了这些指标，表现为与暴露组相比，红色荧光增加，绿色荧光减少，细胞形态改善。这表明GEP-2可以减轻H2O2诱导的氧化应激，并有助于维持线粒体膜电位。
2.2.6. GEP-2通过增强内源性抗氧化防御系统缓解氧化应激
我们通过检测氧化应激引起的损伤和抗氧化能力相关参数，进一步评估了GEP-2的抗氧化应激效应。如图4所示，结果表明，在H2O2刺激后，模型组细胞中MDA的含量显著增加，而GSH、CAT、T-SOD和T-AOC的水平显著降低。这些结果表明H2O2处理有效诱导了氧化应激损伤，证明我们成功构建了细胞氧化应激损伤模型。
用GEP-2预处理24小时后，上述氧化损伤和抗氧化失衡得到了剂量依赖性的部分缓解。所有浓度的GEP-2均显著降低了细胞内MDA含量，同时增强了抗氧化酶的活性。值得注意的是，中、高剂量的GEP-2对GSH和T-SOD的活性以及T-AOC表现出显著的恢复效果，使这些参数恢复到接近甚至相当于正常组的水平。
2.3. 基于转录组学的分析揭示GEP-2缓解氧化应激的机制
2.3.1. 实验组间差异基因表达分析
为探索GEP-2抗氧应激保护作用的分子机制，对对照组、模型组和高剂量组的样本进行了转录组测序。与对照组相比，未经GEP-2预处理的模型组经过H2O2处理后发生了广泛的转录改变，共有3494个差异表达基因（DEGs），包括2627个上调基因和867个下调基因（图5A–C）。这些显著的基因表达变化反映了氧化应激诱导的广泛转录重编程。
相比之下，高剂量GEP-2处理组显示出169个特异性改变的DEGs，其中67个上调，102个下调（图5D）。维恩图分析进一步阐明了三组之间的关系（图5A）。尽管GEP-2响应基因集与损伤相关基因集部分重叠，但两组DEGs在很大程度上是不同的。这种模式暗示GEP-2并非全局逆转H2O2诱导的转录变化，而是选择性地调控与氧化应激反应密切相关的基因子集。
2.3.2. 差异表达基因的基因本体功能富集分析
与对照组相比，模型组的差异表达基因主要富集在免疫相关和发育功能方面。从生物过程角度来看，这些基因与细胞活化、免疫系统调节和对外部刺激的反应显著相关。细胞成分分析表明，这些基因中有相当一部分定位于细胞外区域、质膜和受体复合物。在分子功能水平上，富集主要见于受体配体活性、细胞因子活性和信号受体激活剂活性。总体而言，这种富集模式反映了H2O2暴露诱导的显著免疫炎症反应和细胞重塑。
相反，高剂量GEP-2组的DEGs富集在与细胞稳态维持相关的通路中。在生物学上，显著富集的类别包括对未折叠蛋白的反应、内质网应激反应以及细胞氧化还原稳态的调节。在细胞成分水平，相关基因主要定位于内质网腔、内质网膜以及细胞外囊泡。在分子功能水平，这些基因主要与未折叠蛋白结合、抗氧化活性和分子伴侣功能相关。这强烈暗示GEP-2的保护作用与内在适应性机制密切相关，例如调节内质网应激、促进正确的蛋白质折叠和增强细胞抗氧化能力。
2.3.3. 转录组KEGG和GSEA分析揭示GEP-2在信号通路中的调节功能
本研究对不同组间的DEGs进行了KEGG通路富集分析，以研究与疾病模型相关的生物学通路。结果表明JAK-STAT信号通路显著富集，富集因子约为0.25，表明有大量基因参与。
为了评估高剂量处理对通路调节的影响，通过对模型组和高剂量组进行比较进行了KEGG富集分析。图7B显示JAK-STAT信号通路显著富集，富集因子约为0.04。在对照-模型和模型-高剂量比较中观察到的富集表明，JAK-STAT信号通路在病理条件下失调，并对治疗干预有反应。模型-高剂量比较还揭示了MAPK信号以及抗原处理和呈递通路的富集，暗示了治疗的多通路调节效应。
进行了基因集富集分析以验证KEGG富集结果，并在基因集水平评估通路活性，重点关注JAK-STAT信号通路。如图7C所示，它在“对照 vs. 模型”和“模型 vs. 高剂量”的比较中均显著富集。在“对照 vs. 模型”比较中，归一化富集分数为1.37，在“模型 vs. 高剂量”比较中为1.3，表明该基因集与表型变化呈正相关。富集评分曲线在排序基因列表的顶部达到最大值，核心基因主要分布在leading edge区域。这种模式验证了JAK-STAT通路基因的协同调控，并支持了该通路在疾病建模和治疗背景下具有功能相关性的假设。
2.4. 与GEP-2治疗相关的抗氧化和生存相关信号通路的分子谱分析
2.4.1. GEP-2对JAK/STAT信号通路、抗氧化反应和凋亡相关基因转录水平的调节
进行了RT-qPCR分析，以评估通过转录组富集分析识别的JAK/STAT通路关键组成部分和下游靶标的mRNA表达。特别强调了参与抗氧化防御和细胞存活的基因。与正常组相比，暴露于H2O2显著降低了JAK和STAT3的转录水平。GEP-2预处理减轻了这种降低。高剂量组在氧化应激条件下显著恢复了JAK和STAT3的mRNA表达。作为JAK/STAT通路的典型负调节因子，SOCS3在H2O2暴露后mRNA表达增加。GEP-2预处理以浓度依赖性的方式调节SOCS3表达，导致SOCS3转录水平低于损伤组。与这些变化一致，GEP-2预处理与抗氧化相关基因（包括HO-1和NQO1）的转录升高相关。此外，与细胞存活相关的基因也受到影响，表现为Bcl-2表达增加和Bax表达减少，并且这些变化在较高浓度下更为突出。总之，这些结果表明GEP-2影响了H2O2处理的NCM460细胞中JAK/STAT通路成分、抗氧化防御基因和凋亡相关因子的转录调控。
2.4.2. GEP-2增强Nrf2和JAK/STAT通路中关键蛋白的表达
为了进一步证实转录组富集结果，分析了Nrf2和JAK/STAT信号通路中关键成分的蛋白质表达。如图9所示，与正常组相比，仅用H2O2处理的组中抗氧化转录因子Nrf2及其下游靶点NQO1的蛋白质水平显著降低。用GEP-2预处理以剂量依赖性方式部分恢复了这些水平，导致Nrf2和NQO1蛋白质表达显著增加。这些变化与增强的内源性抗氧化防御机制相对应。
?1) significantly increased pSTAT3 levels in H2O2-induced oxidative stress compared to the untreated group. (C) Representative Western blot showing the expression of Nrf2, NQO1, and β-actin. (D) Quantification of Nrf2/β-actin expression ratio. GEP-2 treatment at 100 and 200 μg·mL?1) significantly enhanced Nrf2 expression compared to the untreated group. (E) Quantification of NQO1/β-actin expression ratio. GEP-2 treatment at 100 and 200 μg·mL?1significantly increased NQO1 expression in response to oxidative stress. Values are expressed as mean ± SEM. Compared with the Control group: *** p < 0.001; Compared with the Model group: ## p < 0.01, ### p < 0.001.">
GEP-2处理与JAK-STAT通路的激活相关。在H2O2诱导组中，STAT3磷酸化（pSTAT3
