《Microorganisms》：Improving Gut Microbiota and Growth Performance of Edible Crickets (Gryllus bimaculatus) by the Probiotic Lactiplantibacillus plantarum TPL-2 from the Guts of the Termite, Termes propinquus
Kittipong Chanworawit,
Putsawee Tomtong,
Pachara Wangsoonthorn,
Kiattawee Choowongkomon and
Pinsurang Deevong
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语
本文从白蚁（Termes propinquus）肠道中分离筛选出具有最强益生特性的植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）TPL-2。研究发现，将该菌株添加到饲料中，可显著促进两斑蟋蟀（Gryllus bimaculatus）的生长、存活，并改善其肠道菌群稳态，为利用昆虫源益生菌提升食用昆虫养殖的产量与安全性提供了新思路。
文章内容归纳总结
摘要
白蚁肠道是一个独特的微生物栖息地，其中蕴藏着因具有抑制病原微生物能力而具备潜在益生特性的细菌。本研究旨在探究从白蚁（Termes propinquus）肠道新分离的乳酸菌的益生特性，以提升常用食用昆虫两斑蟋蟀（Gryllus bimaculatus）的生长性能并降低其食源性病原体污染发生率。研究共分离到5株形态不同的细菌，分别被鉴定为短乳杆菌、植物乳杆菌、咽峡炎链球菌、食伴乳杆菌和绿色气球菌。所有分离株均被评估了对压力条件、细胞表面特性、抗氧化活性、对食源性病原体的抗菌活性、安全谱以及对人类结肠腺癌细胞（Caco-2和HT-29）的粘附能力。其中，植物乳杆菌TPL-2展现出最强的益生属性，并进一步评估了其对食源性病原体的抗粘附活性以及对蟋蟀的体内效应。在饲料中添加植物乳杆菌TPL-2显著改善了蟋蟀的生长、存活和肠道菌群稳态。这些发现表明白蚁来源的乳酸菌在生物技术和食用昆虫养殖中具有作为有益益生菌的应用前景。
1. 引言
益生菌是主要存在于发酵食品、动物胃肠道和自然环境中的有益微生物，包括芽孢杆菌属和乳酸菌（LAB）等，当摄入足量时可对宿主产生健康益处。昆虫益生菌是添加到昆虫饲料中的活微生物，旨在改善昆虫健康、生长性能、疾病抵抗力并帮助调节其肠道微生物组。研究发现，昆虫胃肠道中存在具有益生特性的乳酸菌。许多乳酸菌已被从昆虫中分离出来，并被报道能够促进包括豆娘、黄粉虫、赤拟谷盗和地中海实蝇在内的昆虫的生长、存活并防止病原体入侵。
昆虫是地球上最多样化的动物类群，是提供可持续且营养丰富蛋白质的常用食物来源。昆虫肠道系统中的微生物群落在昆虫健康的各个方面发挥着至关重要的作用，包括支持消化、免疫系统发育和改善营养。在东南亚国家，蟋蟀、蚕和蚱蜢等食用昆虫是常见的街头食品，被视为蛋白质和其他宝贵营养素的替代来源。然而，昆虫携带的食源性病原体，如沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、假单胞菌、大肠杆菌、单核细胞增生李斯特菌和内生孢子形成细菌，可能引发昆虫疾病并传播给人类。减少昆虫中病原体数量的一种替代方法是使用益生菌等微生物控制剂。此外，在昆虫饲料中添加益生菌可用于昆虫养殖，以提高昆虫生长速度和健康水平，并可能保护昆虫、养殖者和消费者免受病原体及其微生物毒素的侵害。
白蚁是可食用昆虫，也是全球许多文化中蛋白质的来源，特别是非洲、亚洲和南美洲。白蚁肠道拥有独特的消化系统，充满了多样的微生物，包括细菌、古菌和原生动物，这些微生物对于消化木材和土壤材料中的纤维素和其他复杂碳水化合物至关重要。白蚁肠道细菌还能够产生针对入侵物种的特异性抗菌化合物。先前研究报道了从白蚁肠道中分离和评估了许多益生芽孢杆菌物种。然而，从白蚁肠道中分离作为益生菌的乳酸菌的研究仍然有限。因此，本研究旨在从白蚁肠道中分离能够用作微生物制剂以促进食用蟋蟀生长、质量和安全性的益生乳酸菌，通过增强肠道菌群平衡、减少病原体污染和防止感染来实现。
2. 材料与方法
2.1. 白蚁、蟋蟀与伦理批准
从泰国呵叻府Sakaerat环境研究站采集土壤/木材取食的高等白蚁，并从泰国良好农业规范标准的蟋蟀养殖场获取14日龄的两斑蟋蟀。实验方案获得了农业大学机构动物护理和使用委员会的批准。
2.2. 从白蚁肠道分离和鉴定乳酸菌
将白蚁样本在12小时内运送到实验室进行分离。用无菌蒸馏水在冰板上清洗白蚁表面三次。总共挤压并均质化30只白蚁的肠道，在MRS琼脂平板上进行分离培养。挑选形态不同的乳酸菌菌落进行过氧化氢酶产生测试和革兰氏染色。此外，使用基因组DNA纯化试剂盒提取选定分离株的细菌基因组DNA。使用通用引物对16S rRNA基因进行PCR扩增。PCR产物由Macrogen公司进行DNA测序。核苷酸序列使用BioEdit进行分析，并通过BLAST程序进行系统学鉴定。还通过VITEK?MS系统进行了MALDI-TOF质谱鉴定。
2.3. 乳酸菌益生特性的评估
2.3.1. 酸和胆盐耐受性
将乳酸菌分离株在MRS肉汤中于37°C低氧条件下培养24小时，然后将细菌悬浮液浊度调整至麦氏浊度0.5。随后，将1%细菌接种物分别接种到pH 2.5的MRS肉汤和添加了0.3%牛胆盐的MRS肉汤中，并在37°C低氧条件下孵育6小时。之后，将悬浮液进行系列稀释并涂布在MRS琼脂平板上。在37°C孵育24小时后，计数菌落形成单位并计算细菌存活百分比。参考益生菌株鼠李糖乳杆菌GG用作测试的阳性对照。存活率通过公式计算。
2.3.2. 细胞表面疏水性
用pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水洗涤乳酸菌细胞三次，并将细胞悬浮液浊度调整至OD600值为0.2。然后，将1 mL悬浮液与等体积的每种烃类混合。将反应混合物涡旋混合并在37°C孵育1小时以分离水相和烃相；然后移去水相。之后，测量烃相在600 nm处的吸光度并计算疏水性百分比。鼠李糖乳杆菌GG用作测试的阳性对照。疏水性通过公式计算。
2.3.3. 自聚集能力
用pH 7.4的PBS洗涤乳酸菌细胞三次，并将悬浮液浊度调整至OD600值为0.2。将细胞悬浮液涡旋混合并在37°C孵育4小时；然后在600 nm处测量吸光度并计算自聚集百分比。鼠李糖乳杆菌GG用作测试的阳性对照。自聚集通过公式计算。
2.3.4. 抗氧化活性
通过改良的方法评估对羟基自由基和DPPH自由基的清除能力。对于羟基自由基清除测定，将乳酸菌悬浮液与1,10-菲咯啉、硫酸亚铁和PBS pH 7.4混合。然后加入1 mL 0.01%过氧化氢以启动反应。在37°C孵育1小时后，测量混合物在536 nm处的吸光度并计算羟基清除活性百分比。为了评估DPPH自由基清除，将乳酸菌悬浮液与DPPH混合。在37°C黑暗条件下孵育1小时后，测量混合物在517 nm处的吸光度并计算DPPH自由基清除活性百分比。参考益生菌株鼠李糖乳杆菌GG和标准抗氧化剂BHT用作测试的阳性对照。抗氧化清除百分比通过公式计算。
