中国首次报道广金钱草（Desmodium styracifolium）是“Candidatus Phytoplasma australasiaticum”相关植原体菌株的新寄主

《Microorganisms》：First Report of Desmodium styracifolium as a Novel Host for ‘Candidatus Phytoplasma australasiaticum’—Related Strains in China Yafei Tang, Zhenggang Li, Mengdan Du, Guobing Lan, Lin Yu, Shanwen Ding, Zifu He and Xiaoman She

本研究报告了中国广东省湛江市广金钱草（Desmodium styracifolium）上一种新的植原体病害。研究人员通过分子检测、系统发育分析和虚拟RFLP（限制性片段长度多态性）分析，鉴定出致病菌株DsLFP-GDZJ属于花生丛枝病植原体组（16SrII组）下的“Candidatus Phytoplasma australasiaticum”菌种，亚组为16SrII-A。这是中国首次报道“Candidatus Phytoplasma australasiaticum”相关植原体侵染广金钱草，从而确立了该植物作为植原体的新寄主，研究结果有助于我们了解中国植原体的分布和分子多样性。

　　

文章内容归纳总结

1. 引言

植原体（Phytoplasmas）是一类属于柔膜菌纲（Mollicutes）、“Candidatus Phytoplasma”属的重要专性原核生物，它们无细胞壁，无法在宿主外进行离体培养。植原体主要通过叶蝉、飞虱和木虱等昆虫媒介传播，也能通过菟丝子和嫁接传播。近年研究还发现植原体可通过种子传播。它们寄主范围广，可侵染数千种植物，引发丛枝、变绿、黄化、小叶、矮化等一系列典型症状，是严重制约全球农业和林业生产的重要病原。

诊断植原体病害通常依赖于症状观察和分子检测。基于16S rRNA（rDNA）基因的分子分析是鉴定和分类植原体的主要手段。当菌株的全长或近全长16S rDNA序列（>1500 bp）与参考菌株的核苷酸同源性大于98.65%时，可被认为属于相应的“Ca. Phytoplasma”物种。当16S rDNA序列不足以区分物种时，可结合其他基因如rp、tuf、secY、secA进行分析。而基于16S rDNA的F2nR2片段的限制性片段长度多态性（RFLP）图谱分析，可将其进一步划分到不同的组和亚组。

广金钱草（Desmodium styracifolium (Osb.) Merr.）是豆科（Leguminosae）山蚂蝗属（Desmodium）植物，在中国传统医药中应用广泛。目前，仅有卵叶山蚂蝗（D. ovalifolium）和三花山蚂蝗（D. triflorum）两种同属植物被报道过受植原体侵染。

本研究在中国广东省湛江市发现了表现典型小叶症状的广金钱草植株。为鉴定致病植原体，我们采用了分子检测、系统发育分析和虚拟RFLP分析等方法。这是中国首次报道与广金钱草小叶病相关的植原体，有助于更好地了解中国植原体的分布和分子多样性。

2. 材料与方法

2.1. 田间调查与样品采集

2024年9月，在中国广东省湛江市（21°15′8″ N, 110°6′11″ E）田间，发现表现小叶症状的广金钱草植株。根据田间症状估算发病率为3.33%（调查约300株，10株发病）。随机采集4株病株和1株健康植株的叶片样本用于分析。

2.2. DNA提取与分子鉴定

使用植物基因组DNA提取试剂盒提取总DNA。采用植原体通用引物对P1/P7和R16mF2/R16mR1扩增16S-23S核糖体基因片段，以及特异性引物对secY-F/secY-R扩增secY基因片段。PCR产物经电泳检测、纯化、克隆后，进行Sanger法双向测序。

2.3. 序列分析

利用BLASTn工具在GenBank数据库中进行序列比对，通过在线MUSCLE工具进行同源性分析。使用MEGA 6.0软件，基于邻接法（邻位相连法，neighbor-joining）并设置1000次重复自举检验，分别构建基于16S rRNA和secY基因序列的系统发育树。使用在线工具iPhyClassifier对16S rRNA基因的F2nR2片段进行虚拟RFLP分析，以确定其16Sr组和亚组。

3. 结果

3.1. 田间调查

2024年9月，在广东湛江麻章区的广金钱草植株上观察到典型的小叶症状，表现为叶片异常变小，这些症状强烈暗示可能存在植原体侵染。

3.2. 分子检测

使用植原体16S rDNA通用引物对P1/P7和R16mF2/mR1对4个病样和1个健康样品进行PCR检测。从所有病样中均成功扩增出预期大小（约1.8 kb或1.4 kb）的片段，而健康样品中无条带。为进一步验证，使用secY-F/secY-R引物对扩增secY基因，同样从所有病样中获得了约1.4 kb的预期片段，而健康样品中无条带。这些结果确证了发病广金钱草植株中存在植原体，并将该菌株暂命名为DsLFP-GDZJ。

3.3. 16S rDNA序列分析

经克隆测序，从病样中获得的P1/P7扩增片段长度为1806 bp，提交GenBank获得登录号PV546888。BLAST分析显示，DsLFP-GDZJ的16S rDNA序列与花生丛枝病组（16SrII组）的植原体菌株同源性最高。进一步MUSCLE分析表明，它与“Ca. Phytoplasma australasiaticum”（亚组16SrII-A和16SrII-D）菌株的序列相似性最高，达99.67%–100%，其中与11个不同寄主来源的菌株序列完全一致。与16SrII-B、16SrII-C、16SrII-L等亚组菌株的同源性则在98.00%–98.56%之间，与16SrI、16SrV、16SrVII等组的菌株相似性则低得多（89.25%–91.12%）。

基于16S rDNA序列的系统发育树分析显示，DsLFP-GDZJ与25个属于16SrII组的植原体菌株聚集在一个主要分支内，表明亲缘关系密切，其中与16SrII-A和16SrII-D亚组的菌株形成了紧密的进化亚分支。虚拟RFLP分析结果显示，DsLFP-GDZJ的F2nR2片段限制性酶切图谱与亚组16SrII-A参考菌株（L33765）完全相同，相似系数为1.00，这进一步证实DsLFP-GDZJ属于16SrII-A亚组。

3.4. secY基因序列分析

克隆测序获得的secY基因扩增片段长度为1425 bp，提交GenBank获得登录号PV553464。BLAST分析显示，DsLFP-GDZJ的secY序列与多个16SrII组植原体菌株的序列同源性为100%。基于secY基因序列的系统发育树分析表明，DsLFP-GDZJ与7个属于亚组16SrII-A和1个属于亚组16SrII-D的菌株聚在一起，这进一步支持了DsLFP-GDZJ是植原体16SrII-A亚组成员。

4. 讨论

植原体病害是全球最具破坏性的植物病害之一，可侵染上千种植物。在中国，已有超过100种植物被报道受多种植原体侵染，对农林生产造成重大经济损失。

本研究首次报道了在中国田间发生的广金钱草小叶病。分子鉴定证实病原为植原体，菌株DsLFP-GDZJ的16S rDNA序列与“Ca. Phytoplasma australasiaticum”的16SrII-A和16SrII-D亚组菌株相似性达99.67%–100%。系统发育分析和虚拟RFLP分析结果均支持其归属于16SrII-A亚组。根据国际植原体分类标准，DsLFP-GDZJ是“Ca. Phytoplasma australasiaticum”的一个新菌株（属于16SrII-A组）。secY基因序列分析也得出相同结论。因此，这是中国首次报道由“Ca. Phytoplasma australasiaticum”菌株引起的广金钱草病害。

在中国，植原体呈现出高度的遗传多样性和广泛的地理分布，已鉴定出12个不同的组。广东省位于中国南部热带和亚热带地区，生物资源丰富，但也深受植原体病害影响。迄今，广东已报道至少存在4个组（16SrI, 16SrII, 16SrV, 16SrVI）的植原体。其中，16SrII组植原体可能是影响广东茄科（Solanaceae）、豆科（Leguminosae）和葫芦科（Cucurbitaceae）植物的优势类群。本研究揭示了广金钱草是16SrII-A亚组植原体的新寄主植物。

本研究有助于了解中国植原体的分布、寄主范围和分子多样性。植原体主要通过叶蝉、飞虱等昆虫媒介传播，因此，切断传播途径是最有效的防治策略。未来需进一步研究植原体的各种传播途径，并规划、制定和实施有效的媒介管理与病害控制策略。

5. 结论

2024年，在广东省湛江市田间发现广金钱草发生一种表现为典型植原体侵染症状（如小叶）的新病害。通过分子生物学方法，检测并鉴定出致病植原体，命名为DsLFP-GDZJ。根据16S rRNA和secY基因的序列相似性分析、系统发育分析，以及16S rRNA基因的虚拟RFLP分析结果，DsLFP-GDZJ是“Ca. Phytoplasma australasiaticum”的一个菌株，属于16SrII-A亚组。据我们所知，这是中国首次报道“Ca. Phytoplasma australasiaticum”（16SrII-A组）与广金钱草小叶病相关，从而确立了广金钱草是植原体的一个新寄主植物。