《Microorganisms》：Design of a Multi-Epitope Vaccine Against Ovine Pasteurella multocida Using Immunoinformatics Strategies
Yanjie Qiao,
Aodi Wu,
Honghuan Li,
Youquan Zhuang,
Qiang Fu,
Li Yang and
Huijun Shi
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本研究旨在利用免疫信息学（immunoinformatics）方法，设计一款针对绵羊多杀性巴氏杆菌（Pm）的多表位疫苗。该研究基于四种保守外膜蛋白筛选了15个免疫优势表位，构建了包含RGD和PADRE佐剂的疫苗。计算机分析表明该疫苗具有良好的理化性质和结构稳定性，并能与TLR2/TLR4有效对接。免疫模拟预测其可有效激发B细胞、T细胞及IFN-γ等关键细胞因子的应答，为开发安全有效的亚单位疫苗奠定了理论基础。
1. 引言
多杀性巴氏杆菌是一种革兰氏阴性菌，是导致绵羊出血性败血症和传染性肺炎的主要病原体，给养羊业造成巨大经济损失。当前疫苗（如灭活疫苗、弱毒活疫苗）存在免疫期短、缺乏交叉保护、毒力返祖风险等问题。多表位疫苗通过整合多个优势B细胞和T细胞表位，可克服单一抗原疫苗免疫原性不足的局限，有效激发细胞和体液免疫，同时降低致敏性和毒性，为疫苗研发提供了新策略。
2. 材料与方法
本研究采用了一套系统的免疫信息学流程。首先，从NCBI数据库获取四种保守外膜蛋白（OmpH、OmpA、PlpE和LolA）的氨基酸序列，并使用VaxiJen v2.0服务器评估其抗原性。接着，利用不同生物信息学工具预测表位：使用ABCpred服务器预测B细胞表位；使用IEDB MHC-I和MHC-II结合服务器分别预测细胞毒性T淋巴细胞（CTL）和辅助性T淋巴细胞（HTL）表位，并进一步用VaxiJen评估抗原性，用IFN-γ表位服务器评估IFN-γ诱导能力。筛选出的表位通过GPGPG连接子融合，并在N端通过EAAAK连接子添加RGD肽和PADRE序列，构建出多表位疫苗候选物Pm-MEV。随后，对Pm-MEV进行了一系列计算评估：使用ProtParam服务器分析理化性质，使用SOLpro服务器预测溶解度，使用AllergenFP和ToxinPred评估致敏性和毒性。二级和三级结构分别用PSIPRED和Robetta服务器预测，并用ProSA-web、ERRAT、PROCHECK和MolProbity进行模型验证。使用ElliPro服务器预测疫苗自身的B细胞表位。为探究免疫识别机制，将Pm-MEV与Toll样受体2（TLR2）和TLR4进行分子对接分析，并使用iMODS服务器进行基于弹性网络的正常模式分析以评估复合物稳定性。最后，利用C-ImmSim服务器进行免疫模拟，并借助JCat工具对疫苗序列进行密码子优化，将其克隆至pET-28a(+)表达载体，完成in silico克隆。
3. 结果
3.1. 优势抗原表位的筛选与Pm-MEV的构建
基于四种优势抗原，共筛选出15个免疫优势表位用于疫苗构建，包括8个CTL表位、3个HTL表位和4个B细胞表位。这些表位通过GPGPG连接子串联，并在N端通过EAAAK连接子融合了RGD肽和PADRE序列，最终构建了由282个氨基酸组成的多表位疫苗Pm-MEV。
3.2. Pm-MEV的抗原性、致敏性与毒性预测
计算分析显示，Pm-MEV具有强抗原性（VaxiJen评分1.24）和免疫原性（IEDB评分为1.7）。其分子量约为28.37 kDa，理论等电点(pI)为4.58，不稳定指数为6.80（<40），表明其结构稳定。平均亲水性(GRAVY)为-0.591，SOLpro预测其可溶性概率为0.87，表明其为亲水性可溶蛋白。此外，该疫苗被预测为非致敏且无毒性。
3.3. Pm-MEV二级与三级结构的预测与分析
二级结构预测显示Pm-MEV主要由无规则卷曲（98.58%）构成。三级结构模型经ProSA-web评估Z值为-4.81，表明模型质量可靠。Ramachandran图分析显示81.6%的残基位于最允许区，ERRAT整体质量因子达92.42，MolProbity评分为1.79，这些指标共同证实了三级结构模型的高质量与可靠性。
3.4. B细胞表位预测
使用ElliPro服务器预测出18个线性B细胞表位和涉及167个残基的不连续B细胞表位，表明疫苗表面存在多个潜在的抗体结合位点。
3.5. Pm-MEV与TLRs的分子对接
分子对接分析表明，Pm-MEV与TLR4复合物的结合自由能为-10.1 kcal/mol，涉及5个氢键和5个盐桥；与TLR2复合物的结合自由能为-4.6 kcal/mol，涉及8个氢键和4个盐桥。这表明Pm-MEV，尤其是与TLR4之间，存在潜在的强结合界面，可能有利于启动免疫应答。
3.6. 基于iMODS的正常模式分析
对Pm-MEV-TLR2和Pm-MEV-TLR4复合物进行的正常模式分析显示，两个复合物均位于势能面的局部最小值，表明结构拓扑稳定。方差分析表明前20个低频模式（尤其是前5个）贡献了超过80%的方差，主导了功能性的构象变化。复合物结合界面处存在复杂的协同与反协同运动模式，这对于结合亲和力与特异性识别可能至关重要。
3.7. 免疫模拟
计算机免疫模拟预测，在绵羊模型中，Pm-MEV在第二次和第三次免疫后可显著提高IgM和IgG抗体滴度，并增加表达IgM和IgG的同种型浆细胞数量。同时，疫苗能诱导B细胞、辅助性T细胞（TH）、活性T细胞和细胞毒性T细胞（CTL）数量的显著扩增，并显著上调干扰素-γ（IFN-γ）和白细胞介素-2（IL-2）等关键细胞因子的表达水平，表明其能激发强大的体液和细胞免疫应答。
3.8. 密码子优化与计算机克隆
疫苗序列经密码子优化后，其密码子适应指数(CAI)达0.96，GC含量为57.21%，表明在Escherichia coliK12系统中具有高效表达的潜力。优化后的基因成功in silico克隆至pET-28a(+)载体的HindIII和EcoRI位点之间，最终重组质粒大小为6201 bp，为后续重组表达奠定了基础。
4. 讨论
与传统疫苗相比，多表位疫苗（MEV）具有生物安全性高、可精准激活特异性免疫应答等优势。本研究针对绵羊多杀性巴氏杆菌，首次利用免疫信息学策略设计了一种多表位疫苗。疫苗构建中引入了RGD肽作为分子佐剂增强抗原性，并加入PADRE序列以拓宽MHC II类结合，从而增强长效免疫应答。GPGPG柔性连接子和EAAAK刚性连接子的使用优化了表位呈递和结构稳定性。
理化性质分析表明Pm-MEV是一个稳定的亲水性蛋白，易于可溶性表达。高质量的三级结构模型为其与免疫受体（如TLR4）的有效相互作用提供了结构基础。分子对接结果显示Pm-MEV与TLR4具有更有利的结合自由能（-10.1 kcal/mol），提示其可能优先通过TLR4通路激活先天免疫。正常模式分析揭示了复合物结合界面的动态运动特征，为其相互作用机制提供了见解。免疫模拟结果乐观地预测了疫苗能激发全面的免疫应答。密码子优化和计算机克隆证实了其在E. coli系统中进行重组表达的可行性。
本研究的局限性在于表位预测使用了人类HLA等位基因而非绵羊OLA分子，这是由于公共数据库中绵羊OLA数据的缺乏，但鉴于MHC结合槽在哺乳动物中的保守性，该方法可作为合理替代。此外，结构稳定性分析使用了iMODS而非全原子分子动力学模拟，但前者已广泛应用于疫苗设计的初步筛选。这些计算结果仍需后续的体外和体内实验验证。
5. 结论
本研究成功利用反向疫苗学和免疫信息学策略，设计出一款针对多杀性巴氏杆菌的多表位疫苗Pm-MEV。计算分析表明该疫苗具有高抗原性、良好的安全性特征，能够与TLR4稳定结合，并预测能在宿主体内诱导强大而持久的体液和细胞免疫应答。这些发现为快速开发抗Pm疫苗提供了设计基础和理论框架。但需注意，所有结论均基于计算机模拟，其实际的免疫保护效果和安全性有待后续体外和体内实验的进一步验证。
