《Microorganisms》：Antibacterial Activity of the Pyrazolone Copper Complex P-FAH-Cu-phen Against Staphylococcus aureus and Promotion of Healing of Traumatized Infected Skin in Mice
Dongyuan Zhou,
Changyi Nie,
Guancheng Xu,
Guoxuan Xie,
Marhaba Nurmamat,
Tamasha Kurmanjiang,
Chunyu Liu and
Jinyu Li
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本文首次在中国报道了由“Candidatus Phytoplasma australasiaticum”（澳洲植原体）16SrII-A亚组菌株引起的广金钱草（Desmodium styracifolium）小叶病。2024年9月，在广东湛江田间发现典型小叶症状，经分子检测（PCR扩增16S rDNA、secY基因）、序列分析和虚拟RFLP鉴定，确认为“Ca. Phytoplasma australasiaticum”新菌株，命名为DsLFP-GDZJ。此研究扩展了植原体在豆科药用植物的宿主范围，为中国植原体的分布、多样性与防控提供了关键信息。
引言
植原体（Phytoplasma）是一类隶属于Candidatus Phytoplasma属的专性寄生无细胞壁原核细菌，具有多形性，基因组较小，主要寄生于植物韧皮部和昆虫血淋巴。它们由叶蝉、飞虱等昆虫媒介传播，可侵染数千种植物，导致丛枝、黄化、小叶、花变叶等典型症状，是全球农林生产的重要威胁。分子诊断，特别是基于16S rRNA基因序列的分析，是植原体鉴定的主要方法，当16S rDNA序列无法区分时，常辅以核糖体蛋白基因（rp）、延伸因子Tu基因（tuf）、易位酶Y基因（secY）等管家基因进行分析。
广金钱草（Desmodium styracifolium），又名“Guang Jin qian cao”，是豆科（Leguminosae）山蚂蝗属的一种重要药用植物。此前仅有卵叶山蚂蝗（D. ovalifolium）和三花山蚂蝗（D. triflorum）被报道感染植原体。本研究旨在鉴定广东湛江地区首次发现的广金钱草小叶病的病原，以丰富对中国植原体分布和分子多样性的认识。
材料与方法
田间调查与样品采集
2024年9月，在广东省湛江市麻章区（21°15′8″ N, 110°6′11″ E）的田间观察到广金钱草植株表现出典型的小叶症状，其特征是叶片异常变小。调查了约300株植物，其中10株出现症状，发病率为3.33%。采集了4株病叶样本和1株健康叶样本用于分析。
DNA提取与分子鉴定
使用EasyPure Plant Genomic DNA Kit提取叶片总DNA。采用通用引物对P1/P7、R16mF2/R16mR1靶向16S-23S核糖体基因，以及特异性引物对secY-F/secY-R靶向secY基因进行PCR扩增。扩增程序为：94°C 10分钟，随后35个循环（94°C 30秒，50°C 30秒，72°C 2分钟），最后72°C延伸10分钟。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，目标条带纯化后克隆至pMD-19T载体，转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆进行Sanger法双向测序。
序列分析
对测序获得的16S rDNA和secY序列，通过NCBI的BLASTn程序进行初步比对。使用在线MUSCLE工具进行序列同源性分析。利用MEGA 6.0软件，采用邻接法构建16S rRNA基因和secY基因的系统发育进化树，自举检验1000次。通过在线工具iPhyClassifier对16S rRNA基因的F2nR2片段进行虚拟RFLP分析，以确定植原体的16S rRNA组和亚组。
结果
分子检测
使用植原体通用引物对P1/P7和R16mF2/mR1对所有样本进行PCR检测。在4个感病样本中均扩增出预期的约1.8 kb和约1.4 kb 16S rDNA片段，而健康样本中无扩增产物。使用引物对secY-F/secY-R对secY基因的扩增也得到了一致结果。这些结果证实了病原为植原体，并初步将其命名为广金钱草小叶植原体（DsLFP-GDZJ）。
16S rDNA序列分析
通过P1/P7引物对扩增获得了一段1806 bp的序列，包含16S rDNA、16S-23S rDNA基因间隔区（含tRNA基因）和部分23S rDNA序列。该序列在GenBank的登录号为PV546888。BLAST和MUSCLE分析显示，DsLFP-GDZJ的16S rDNA序列与花生丛枝（Peanut witches' broom）组（16SrII组）的植原体菌株同源性最高，尤其与“澳洲植原体”（‘Ca. Phytoplasma australasiaticum’，亚组16SrII-A和16SrII-D）菌株的序列同源性高达99.67%–100%。其中，与11个来自不同寄主植物的菌株序列完全一致（100%同源）。与16SrII-B、16SrII-C、16SrII-L等亚组菌株的同源性则在98.00%–98.56%之间。而与16SrVII、16SrV、16SrI等组的菌株相似性很低（89.25%–91.12%）。
系统发育分析进一步表明，DsLFP-GDZJ与16SrII组的25个菌株聚在一个主要分支内，其中与16SrII-A和16SrII-D亚组的菌株形成了紧密的进化小分支。
通过iPhyClassifier对DsLFP-GDZJ的16S rRNA基因F2nR2片段进行虚拟RFLP分析。结果显示，DsLFP-GDZJ的限制性酶切图谱与16SrII-A亚组的参考菌株L33765完全一致，相似系数为1.00，这进一步证明DsLFP-GDZJ属于16SrII-A亚组。
secY基因序列分析
通过secY-F/secY-R引物对扩增获得了一段1425 bp的序列，包含完整的secY基因编码区。该序列在GenBank的登录号为PV553464。BLAST分析表明，DsLFP-GDZJ的secY序列与多个属于16SrII组的植原体菌株（包括4个“澳洲植原体”菌株）的secY序列具有100%的一致性。基于secY基因序列构建的系统发育树显示，DsLFP-GDZJ与来自16SrII-A亚组的7个菌株和1个来自16SrII-D亚组的菌株聚在一起，进一步支持了16S rDNA分析的结果。
讨论
植原体病害是全球范围内最具破坏性的植物病害之一。在中国，已有超过100种植物被报道感染植原体。本研究发现，2024年在广东湛江田间首次出现的广金钱草小叶病，其病原被确定为“澳洲植原体”的一个新菌株，命名为DsLFP-GDZJ，隶属于16SrII-A亚组。这项研究是“澳洲植原体”在广金钱草上引起病害的首次报道，从而确立了广金钱草作为一种新的植原体寄主植物。
在中国，植原体遗传多样性丰富，已报道有12个不同的组别。广东省地处中国南部的热带和亚热带地区，植原体病害发生严重，迄今已报道存在至少4个组（16SrI, 16SrII, 16SrV, 16SrVI）。其中，16SrII组植原体是影响茄科、豆科和葫芦科植物的优势类群。本研究揭示了广金钱草是16SrII-A亚组植原体的新寄主。为制定有效的媒介防控和病害控制策略，后续需要进一步研究植原体的多种传播途径，以阻断其传播链。
结论
本研究发现广东省湛江市田间广金钱草发生了一种新的植原体病害，表现为典型的小叶症状。通过分子生物学方法，鉴定出其病原为一种新的植原体菌株，命名为DsLFP-GDZJ。基于16S rRNA和secY基因的序列相似性分析、系统发育分析，以及对16S rRNA基因的虚拟RFLP分析结果，证实DsLFP-GDZJ是“Candidatus Phytoplasma australasiaticum”的一个菌株，属于16SrII-A亚组。本研究是“澳洲植原体”（16SrII-A组）引起广金钱草小叶病在中国的首次报道，从而确定了广金钱草是植原体的新寄主植物，为理解中国植原体的分布、宿主范围和分子多样性提供了新的信息。
