《Plants》：Acute Combination of Nitrogen Deprivation and High Irradiance Induces the Simultaneous Accumulation of Astaxanthin and Lutein in Continuous Cultures of the Microalga Chromochloris zofingiensis
María Morales-Pineda,
Mercedes García-González,
M. Elena García-Gómez,
Francisco J. Romero-Campero and
Marcos Ramos-González
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本文通过氮限制与光照调控，优化了Chromochloris zofingiensis微藻连续光自养培养体系，揭示了氮可用性（N）是调控类胡萝卜素（Carotenoids）积累的主导因子，高光（HL）在氮限制下协同增强虾青素（Astaxanthin）积累，并通过CYP97A1、CYP97C、BKT1等关键酶基因的差异表达阐明了代谢流协同调控的分子机制，为实现目标产物比例可编程的工业化生产提供了理论基础。
2. 结果与讨论
2.1. 高稀释率有利于虾青素和叶黄素的积累
在连续培养体系中，稀释率、硝酸盐供应、光照强度（平均辐照度，Iav）和比硝酸盐输入（SNI）等因素显著影响了Chromochloris zofingiensis生物量中叶黄素和虾青素的含量。当培养液中的硝酸盐浓度从1 mM增加到10 mM时，所有测试稀释率下的虾青素含量均逐渐降低。在较高的稀释率下，虾青素含量更高，例如在1 mM硝酸盐和0.5-0.9 d?1稀释率下，虾青素含量超过7 mg/g干重。相比之下，叶黄素含量在硝酸盐供应增加时基本保持恒定，在高稀释率下含量大于10 mg/g干重，并且叶黄素积累量随着稀释率的增加而上升。这反映了两种类胡萝卜素的差异积累模式：叶黄素作为初级类胡萝卜素，在非限制性生长条件下积累更多；而虾青素作为次级类胡萝卜素，在生长受限条件下积累更优。
2.2. 氮可用性极大地影响类胡萝卜素含量
在特定稀释率下，硝酸盐供应对不同类胡萝卜素在干生物量中含量的影响被深入分析。当稀释率为0.5 d?1时，叶黄素水平基本保持不变，约为11 mg/g干重，尽管培养液中的硝酸盐浓度发生了显著变化。相反，虾青素水平随着培养液中氮可用性的增加而降低，在1 mM硝酸盐时达到最大值，在10 mM硝酸盐时达到最小值。这表明虾青素的积累在营养限制条件下最大化，这与氮可用性是诱导C. zofingiensis积累虾青素的关键因素的观点一致。
研究还发现，C. zofingiensis细胞中虾青素和叶黄素的相对水平与生物质的氮含量相关。当细胞氮含量最低时，虾青素含量达到最高，而叶黄素含量则表现出相反的趋势，随着细胞氮含量的增加而增加。通过比硝酸盐输入（SNI）来分析，也证实了氮供应的影响：当SNI最低时，虾青素生产率最高；而当SNI接近较高值时，叶黄素生产率最高。这些结果与先前关于低氮可用性或高碳氮比条件下C. zofingiensis虾青素含量急剧增加、叶黄素含量降低的报告相符。
2.3. 高辐照度仅在氮限制下增加虾青素水平
研究在特定稀释率下，考察了平均辐照度对叶黄素和虾青素含量的影响。在氮供应不限制时，增加平均辐照度会导致叶黄素含量增加，但虾青素水平几乎不受影响。然而，在氮限制条件下，情况发生改变，两种类胡萝卜素（虾青素和叶黄素）的积累均对光可用性有响应。当平均辐照度接近500 μE m?2s?1时，干生物质中的叶黄素含量接近30 mg/g，虾青素含量增加至7 mg/g以上。因此，可以得出结论：虾青素的积累仅在细胞氮受限时才表现出对辐照度的依赖性，在氮供应充足时则无此现象。
2.4. 硝酸盐和光胁迫的协同效应通过特定基因的差异表达调控虾青素和叶黄素含量
转录组分析被用于阐明C. zofingiensis在转录水平的变化与虾青素、叶黄素积累变化之间的关系。将每个条件与低光高氮对照条件比较，发现差异表达基因的数量存在巨大差异。高光单独作用激活了76个基因，抑制了179个基因。氮剥夺显著增加了受影响的基因数量。两种胁迫的联合作用产生了最大影响，激活了974个基因，抑制了637个基因。所有胁迫条件均抑制了与光合作用过程相关的基因，而激活的基因则取决于具体的胁迫条件。
在C. zofingiensis中，参与类胡萝卜素生物合成途径的所有酶都已被鉴定。分析显示，氮可用性是影响类胡萝卜素含量的主要调节因子，而光则作为一个独立因子以及氮胁迫响应的调节因子起作用。在低硝酸盐条件下，次级类胡萝卜素如虾青素、角黄素、虾红素的含量明显增加。同时，在α-胡萝卜素分支中，α-胡萝卜素含量急剧减少，而叶黄素积累增加。光的影响与硝酸盐类似，但幅度较小。当两种因子结合时，产生了最显著的变化，表现出协同效应。一个明显的例子是虾青素，其在联合胁迫下的增加量大于单独硝酸盐胁迫和单独光胁迫效应之和。
代谢流被导向β-胡萝卜素，这是由于负责将番茄红素转化为α-或β-胡萝卜素的环化酶水平差异所致。β-环化酶在所有胁迫条件下均上调，而α-胡萝卜素生产所需的ε-环化酶被强烈抑制。这导致α-胡萝卜素产量减少，可用的番茄红素被引导至β-胡萝卜素分支。然而，在所有胁迫条件下，负责叶黄素生产的羟化酶CYP97A1的表达上调，以及在强光条件下CYP97C的表达上调，这解释了叶黄素水平的轻微增加，改变了叶黄素与α-胡萝卜素的比例。
关于虾青素的积累，β-胡萝卜素羟化酶的表达模式至关重要。在低氮条件下，编码该酶的基因表达增加，导致玉米黄质水平上升和β-胡萝卜素含量减少。在强光胁迫下，β-胡萝卜素水平轻微增加，这与该酶表达无变化以及玉米黄质水平维持一致。BKT酮醇酶负责将β-胡萝卜素转化为角黄素，将玉米黄质转化为虾红素，再将虾红素转化为虾青素。BKT1的表达水平与虾红素和虾青素的含量高度正相关，而BKT2则呈负相关。这表明BKT1是催化这些反应的主要酶，而BKT2的作用可能仅限于基础水平的虾青素生产。
综合分析表明，硝酸盐浓度对基因表达的影响占主导地位，尤其是对产生酮类胡萝卜素的酮醇酶。对于羟化酶和环化酶，光和硝酸盐的影响总体相似，具体因酶而异。两种因子的相互作用影响了负责途径最终产物生成的酶，如CYP97A1、CYP97C和BKT1，从而整合胁迫信号以改变最终积累量。具体而言，硝酸盐剥夺通过控制相应的环化酶，将碳通量导向β-胡萝卜素，并通过BKT1的过表达将其转化为虾青素。此外，高辐照度通过刺激CYP97A1和CYP97C的表达，将有限的剩余α-胡萝卜素转化为叶黄素。这导致了叶黄素和虾青素的共积累，并且可以通过调节培养液中的硝酸盐含量和辐照度来调整两者的比例，以达到所需的目标值。
3. 材料与方法
3.1. 藻株与培养条件
实验使用C. zofingiensis CCAP 211/14藻株。培养在2 L光生物反应器中进行，温度维持在25°C，pH维持在7.5。光照由六个白光灯提供，模拟太阳中性光周期。通过调节反应器表面的入射辐照度来设定不同的光强条件。连续培养模式在光照期间以不同的稀释率进料。平均辐照度根据入射辐照度、生物质浓度、光程和消光系数计算得出。硝酸盐可用性通过比硝酸盐输入来量化。对于转录组分析，C. zofingiensis在固定的稀释率、两种硝酸盐浓度和两种最大辐照度下培养。
3.2. 分析方法
生物质浓度通过干重法测定。类胡萝卜素（虾青素、叶黄素和总类胡萝卜素）含量的测定采用从冻干生物质中提取细胞的方法。氮含量通过元素分析仪测定。培养液中的硝酸盐浓度通过分光光度法在210 nm波长下测定。
3.3. RNA测序数据生成与处理
RNA提取采用机械破碎法，并使用商业试剂盒纯化。使用Illumina平台进行测序。基因表达定量使用MARACAS计算流程，以C. zofingiensis基因组序列为参考。差异表达基因基于倍数变化和调整后的p值阈值确定。基因本体富集分析基于相应基因组注释进行。通过双因素方差分析确定每个因素及其相互作用对类胡萝卜素水平及其生物合成相关基因的影响。基因表达水平与类胡萝卜素含量之间的相关性使用皮尔逊方法计算。
