《Plants》：Red and Far-Red LED Lighting Enhances Protoplast-to-Plant Regeneration in Broccoli (Brassica oleracea var. italica)
Miriam Romero-Mu?oz,
José Manuel Gambín-Sánchez,
Francisco José Vidal-Sánchez,
José E. Cos-Terrer and
Margarita Pérez-Jiménez
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本研究通过优化酶解配方、培养基组合，并创新性地引入红光与远红光（R+FR）LED光照，显著提升了西兰花（Brassica oleracea var. italica）原生质体的再生效率。实验表明，红光/远红光处理显著促进了微愈伤组织形成、植板效率（plating efficiency）和不定芽再生，为基于CRISPR/Cas的基因组编辑和体细胞杂交育种提供了高效、实用的技术平台。
2. 研究结果
2.1. 原生质体分离方案的优化
为确定西兰花‘Claremont’品种叶片原生质体分离的最佳酶解配方，研究评估了三种不同纤维素酶（Cellulase R-10）和离析酶（Macerozyme R-10）浓度的组合。结果表明，三种酶溶液处理下的原生质体存活率无显著差异。然而，原生质体产量受酶配方影响显著。使用中等酶溶液（1.5% Cellulase R-10 + 0.4% Macerozyme R-10）获得了最高的总产量和活细胞产量，相对于低酶和高酶溶液分别高出20.6%和61.4%。因此，该中等酶配方在高效消化细胞壁与保持原生质体完整性之间取得了最佳平衡，被选用于后续所有实验。
2.2. LED光照下的原生质体培养
为改善再生效率，研究测试了不同培养基和LED光照处理对原生质体培养的影响。在所有处理和培养基中，培养后第3天（DAC）观察到了首次细胞分裂。在红光+远红光（R+FR）LED处理或黑暗（对照）条件下，按照Protocol 1培养的原生质体在第二周即可清晰看到微愈伤组织克隆形成；而蓝光（B）处理下再生缓慢，克隆直到第四周才明显可见。在Protocol 2下，微愈伤组织出现更晚。代表性图像展示了从分离的分裂原生质体到小型球形微愈伤，再到较大、结构致密的愈伤团块的转变过程，部分愈伤已显示出早期器官发生特征，如分生组织状圆顶和根状突起。
培养15天后的总响应频率分析显示，在Protocol 1下，红光+远红光处理的结果显著高于蓝光处理。在Protocol 2下，红光+远红光处理的结果显著高于对照和蓝光处理。双因素方差分析（ANOVA）表明，培养基、光质及其交互作用对15天时的总响应频率均有显著影响。培养45天后的植板效率（plating efficiency）和集落形成效率（colony-formation efficiency）分析进一步证实，在Protocol 1和2中，蓝光处理下的值均显著低于对照和红光+远红光处理。双因素方差分析揭示光质对植板效率有显著的主效应。
2.3. LED处理下的从头不定芽再生
转移到再生培养基后，所有光处理下均在37天后检测到不定芽再生，但再生百分比和不定芽数量因光质而异。红光+远红光处理获得了最高的再生百分比和不定芽产量，而蓝光处理最低。红光+远红光下的再生率约为蓝光下的8倍，是对照（白光）下的2倍多。同样，红光+远红光下的不定芽数量约为蓝光下的5倍，是对照下的近4倍。在培养基方面，添加活性炭的培养基中不定芽数量显著高于未添加的对照培养基。广义线性模型（GLM）分析确定，光质是影响不定芽数量和再生概率的显著预测因子。
2.4. 体外增殖、生根与驯化
评估了不同浓度苄氨基嘌呤（BAP）对不定芽增殖的影响。所有测试的BAP浓度（0.3, 0.5, 0.8 mg L-1）均支持不定芽增殖，新形成的不定芽数量在7.6到10.2之间，但BAP浓度对新增不定芽数量或增殖率无显著影响。然而，玻璃化（vitrification）受BAP浓度影响显著，最低浓度（0.3 mg L-1）下的玻璃化百分比显著低于较高浓度。对于体外生根，测试了三种不同生长素组成的培养基：无激素培养基、添加1 mg L-1NAA或1 mg L-1IBA的培养基。所有处理的生根率都很高，但根的数量和形态差异显著。在无激素培养基上培养的不定芽发育出的根系数量最多、最长，形成密集、分枝良好的根系，最有利于后续驯化。
-1 IBA组合）对新再生不定芽数量（A）、玻璃化百分比及增殖率（B）的影响。">
-1 NAA，（C）含1 mg L-1IBA，以及（D）再生的生根植株。">
3. 讨论
本研究结果突显了光质，特别是红光LED照明，作为原生质体再生中一个关键且此前未充分利用的因素。优化的酶混合物（1.5% Cellulase R-10 + 0.4% Macerozyme R-10）获得了高产量的有活力原生质体。但本研究的主要创新在于证明红光LED光照能显著增强原生质体再生，这是首次在芸薹属作物中将红光LED照明与增强的原生质体来源植株再生联系起来的实验证据。红光+远红光的促进作用可能与其调节次生代谢、氧化还原稳态和光形态建成信号的能力有关，这些因素与细胞的分化能力密切相关。红光和远红光波长主要通过光敏色素（phytochrome）系统感知，该系统动态影响细胞周期调控、激素响应和分生组织活性。相反，蓝光常与应激反应、活性氧（ROS）水平升高和组织培养中增殖减少相关，这与我们在蓝光LED下观察到的微愈伤形成和再生显著减少一致。活性炭的添加可能通过吸附抑制性酚类物质和过量激素起作用，而红光则促进代谢上有利且应激较小的环境。关于细胞分裂素效应，一旦原生质体来源的不定芽建立，测试的BAP浓度范围内的确切细胞分裂素水平变得不如早期培养条件（包括光 regime）关键。然而，降低细胞分裂素水平可以有效减轻玻璃化。同样，在无激素培养基中更高的生根效率支持了过量外源生长素可能抑制芸薹属植物生根的观点。总体而言，本研究强调了将光质作为原生质体培养系统中一个可控的、具有生物学意义的参数的价值。
4. 材料与方法
研究使用商业西兰花品种‘Claremont’。种子灭菌后于MS培养基上萌发，5周龄植株的幼叶用于原生质体分离。测试了三种酶溶液进行过夜消化。纯化后的原生质体用荧光素二乙酸酯（FDA）评估存活力，并包埋于海藻酸钙层中。测试了两种增殖培养基（Protocol 1和2）以及三种LED光处理（黑暗对照、蓝光、红光+远红光）。培养60天后，将含微愈伤组织的海藻酸层转移至固体不定芽再生培养基，培养基分添加或不添加活性炭两种，并在三种光处理下培养。再生不定芽被切除并转移到含有不同浓度BAP的增殖培养基上。最后，将不定芽转移到三种不同的生根培养基上诱导生根。数据收集包括总响应频率、植板效率、集落形成效率、再生百分比、不定芽数量、增殖率、玻璃化百分比、生根率、根数和根长。使用方差分析（ANOVA）和广义线性模型（GLM）进行统计分析。
5. 结论
本研究为西兰花建立了一个高效的原生质体-植株再生系统，并确定光质，特别是红光+远红光LED照明，是再生过程中的关键促进因子。优化的酶溶液（1.5% Cellulase R-10 + 0.4% Macerozyme R-10）在原生质体产量和存活率间提供了最佳平衡。在此条件下，海藻酸包埋的原生质体在红光LED或黑暗条件下培养时再生效率最高，而蓝光持续降低微愈伤形成、植板效率和整体再生性能。从头不定芽再生在所有光处理下均可获得（蓝光在对照培养基中除外），并在红光+远红光与含活性炭的培养基结合时达到最大化，反映了光谱质量和培养组成的叠加贡献。不定芽增殖不受测试BAP浓度的显著影响，而无激素培养基中的根形成效率高于添加生长素的培养基。总体而言，研究结果证明红光LED可作为西兰花原生质体来源再生的有效促进剂，并提供了首批关于LED辅助的西兰花原生质体-植株再生的报道实例之一。本文开发的方案能够在大约5个月内产生完整植株，为基于CRISPR的基因组工程、体细胞杂交和其他高级育种策略提供了一个实用平台。
