针对TNAU Papaya CO 8番木瓜品种的高效体细胞胚发生与成株再生体系研究

《Plants》：Development of an Efficient Somatic Embryogenesis Protocol for Carica papaya L. Var. TNAU Papaya CO 8 on Different Basal Media Shalini Chandrasekar, Kavitha Chinnasamy, Ganga Mathian, Krish K Kumar, Babu Rajendra Prasad, Manoranjitham S. Karuppannan, Selvaraju Kanagarajan and Saraladevi Muthusamy

本文开发了番木瓜品种TNAU Papaya CO 8高效、可重复的体细胞胚发生（SE）协议，首次系统比较了MS、N6和WPM三种基本培养基的优劣。该研究优化了包括外植体、植物生长调节剂（PGRs）在内的全流程，实现了从愈伤诱导、胚成熟、植株再生、生根到驯化的成功，建立了适用于大规模克隆繁殖和遗传转化应用的可靠体系。

　　

Development of an Efficient Somatic Embryogenesis Protocol for Carica papaya L. Var. TNAU Papaya CO 8 on Different Basal Media

番木瓜（Carica papaya L.）因其高经济价值和广泛用途成为重要的热带水果作物。然而，其常规种子繁殖会导致后代遗传变异大，而传统的营养繁殖方法效率低下且可能传播病毒。因此，建立高效的体外再生体系对于番木瓜优良品种的大规模、无性克隆繁殖至关重要。体细胞胚发生（SE）作为一种有效的体外再生途径，不仅在植株生产方面具有潜力，也是遗传转化、突变研究和人工种子生产的重要平台。

1. 引言

番木瓜营养丰富，用途广泛，但传统繁殖方式存在局限性。体外繁殖技术，特别是体细胞胚发生，为克服这些限制提供了有效方案。然而，番木瓜被认为是体外培养的难生根物种，其体细胞胚诱导高度依赖基因型，并常伴随愈伤褐化、胚发生频率低等问题。本研究旨在为TNAU Papaya CO 8这一高产品种开发一套高效、可重复的体细胞胚发生方案，以解决其因种子繁殖导致的性别早期鉴定困难和遗传纯度保持等问题。

2. 结果

2.1. 愈伤组织诱导与胚发生百分比（%）

研究以未成熟合子胚为外植体，在添加了不同浓度2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）和毒莠定的1/2 MS、1/2 WPM和1/2 N6培养基上进行培养。结果表明，在不含生长调节剂的对照中未观察到形态发生反应。在1/2 MS培养基上添加2.0 mgL^?12,4-D时，获得了最高的愈伤诱导率（81.96%）和胚发生百分比（77.82%），且诱导时间最早（18.00天）。1/2 N6和1/2 WPM培养基的表现次之。毒莠定处理普遍延迟了愈伤组织的启动。

2.2. 体细胞胚的成熟

体细胞胚经历了明显的球形胚、心形胚、鱼雷形胚和子叶胚等发育阶段。胚成熟阶段，在MS培养基中添加1.0 mgL^?1ABA（脱落酸）、0.4 mgL^?1BAP（6-苄氨基嘌呤）和0.6 mgL^?1脯氨酸获得了最高的胚成熟率（61.25%）。ABA浓度过高或添加PEG（聚乙二醇）均会降低成熟率。

2.3. 体细胞胚再生与茎伸长

子叶期胚在添加了2.0 mgL^?1腐胺（Putrescine）的MS培养基中获得了最高的植株再生率（85.02%），且叶片出现早，茎长最大。而在所有培养基中，添加了1.0 mgL^?1GA₃（赤霉酸）的MS培养基使茎伸长效果最佳（6.57 cm）。浓度过高则会抑制伸长。

2.4. 根诱导与驯化

生根实验表明，在1/2 MS培养基中添加1.0 mgL^?1IBA（吲哚丁酸）、0.5 mgL^?1NAA（萘乙酸）、1.0 mgL^?1间苯三酚（Phloroglucinol）和1.0 gL^?1活性炭（Activated Charcoal）的组合效果最好，生根率达75.01%，根数多，根长长。驯化阶段，使用椰糠和蚯蚓粪（1:1）的基质，使来自MS培养基的植株获得了最高的存活率（74.01%）。

3. 讨论

本研究成功为TNAU Papaya CO 8番木瓜品种建立了一套完整的体细胞胚发生再生体系。MS培养基在愈伤诱导、胚成熟和植株再生等多个阶段均表现优于WPM和N6培养基，这可能归因于其更高的总盐浓度和平衡的养分组成。2,4-D在诱导胚性愈伤方面比毒莠定更有效，但浓度需优化以防止毒性和体细胞克隆变异。ABA和脯氨酸能协同促进胚成熟，而腐胺显著提高了体细胞胚的萌发和再生。GA₃优化了茎的伸长，而IBA、NAA结合活性炭和间苯三酚则极大地改善了生根效率。最终的驯化成功证明了该体系在生产可移栽健壮植株方面的可行性。该协议的高再生效率和存活率，凸显了其在番木瓜优良品种快速克隆繁殖和大规模生产中的巨大应用潜力。

4. 材料与方法

4.1. 种植材料与消毒

从田间母株上获取TNAU Papaya CO 8品种授粉后90-100天的未成熟果实。经过严格的表面消毒后，在无菌条件下取出种子，并解剖获得未成熟合子胚作为外植体。

4.2. 基本营养培养基的制备

使用了MS、WPM和N6三种基本培养基，并补充了维生素、氨基酸和肌醇。蔗糖作为碳源，MS和N6培养基添加30.0 gL^?1，WPM添加20.0 gL^?1。培养基pH分别调整至5.7±0.1（MS）和5.75±0.5（WPM，N6）。

4.3. 愈伤组织的诱导与增殖

将外植体接种于添加了不同浓度2,4-D或毒莠定的1/2强度培养基上，在黑暗条件下诱导愈伤。每15天继代一次以促进愈伤增殖。定期在体视显微镜下观察胚性愈伤和体细胞胚的不同发育阶段，并统计愈伤诱导率和胚发生率。