《Toxics》：Bisphenol F Drives Endoplasmic Reticulum Stress-Mediated Macrophage Polarization, Leading to Inflammation and Fibrosis in Mouse Kidneys
Chenjiao Miao,
Yang Fu,
Binwen Zhang,
Wangyong Yu,
Miao Song,
Yanfei Li and
Zheng Cao
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本研究创新性地揭示了双酚F（BPF）通过激活肾脏内质网（ER）应激关键通路（PERK/eIF-2α/ATF-4/NF-κB 与 IRE1/TRAF2/JNK/ATF-6），诱导肾巨噬细胞向M1/M2型极化，进而驱动炎症因子（IL-6, TNF-α, IL-1β）与促纤维化因子（TGF-β1）分泌，最终通过巨噬细胞-肌成纤维细胞转分化（MMT）、上皮-间质转化（EMT）及成纤维细胞-肌成纤维细胞转分化（FMT）导致肾纤维化与功能障碍。内质网应激抑制剂4-苯基丁酸（4-PBA）可逆转上述过程，为阐明BPF肾毒性机制及潜在防治策略提供了新见解。
1. 引言
双酚A（BPA）作为一种应用广泛的内分泌干扰物，其健康风险已引发全球关注，并促使各国对其使用进行限制。在此背景下，双酚F（BPF）作为BPA的主要替代品，其生产和环境检出量逐年上升，甚至在人体尿液和血液样本中检出率高、浓度显著，提示其潜在的人群暴露风险不容忽视。鉴于BPF与BPA化学结构相似，其可能具有类似的器官毒性。已有研究表明，BPF暴露可导致血清尿酸和尿蛋白水平升高，并与肾脏疾病风险增加相关，但其导致肾损伤的具体毒理学机制尚不明确。本研究通过分子对接分析预测了BPF与内质网（ER）应激关键应答蛋白（PERK、IRE1、ATF-6）存在潜在相互作用，进而提出假设：ER应激可能介导了BPF诱导的肾毒性。为验证此假设，研究建立了体内（小鼠）和体外（Raw264.7巨噬细胞等）BPF暴露模型，并利用ER应激抑制剂4-苯基丁酸（4-PBA）进行药理学干预，系统探讨了BPF相关肾损伤的潜在机制。
2. 材料与方法
研究使用50只雄性昆明小鼠，随机分为5组：对照组（C）、低剂量BPF组（L, 0.5 mg/kg）、中剂量BPF组（M, 5 mg/kg）、高剂量BPF组（H, 50 mg/kg）以及干预组（4-PBA+BPF, 100 mg/kg 4-PBA + 5 mg/kg BPF）。通过每日灌胃给药，持续28天。通过检测血清肌酐（SCr）评估肾功能；通过苏木精-伊红（HE）染色、马松（Masson）染色观察肾脏组织病理学变化和胶原沉积；采用免疫组化、免疫荧光、酶联免疫吸附试验（ELISA）、定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）和蛋白质印迹（Western blotting）等技术评估炎症、纤维化、巨噬细胞极化及ER应激相关蛋白的表达。分子对接用于预测BPF与ER应激蛋白的结合。体外实验使用Raw264.7巨噬细胞系，建立BPF暴露（40 μM, 48 h）及4-PBA干预模型，并通过与TCMK-1（肾小管上皮细胞）和NIH3T3（成纤维细胞）共培养体系，研究巨噬细胞极化对上皮-间质转化（EMT）和成纤维细胞-肌成纤维细胞转分化（FMT）的影响。
3. 结果
3.1. BPF导致小鼠肾功能障碍、纤维化和炎症
结果显示，中、高剂量BPF暴露显著降低了小鼠肾脏系数或体重，并提高了血清肌酐（SCr）水平，表明肾功能受损。马松染色显示BPF诱导了肾脏胶原纤维沉积。HE染色结果显示BPF引起了肾组织炎症细胞浸润、肾小管上皮细胞脱落和肾小球萎缩。这些结果表明BPF诱导的肾功能障碍与肾脏纤维化和炎症相关。
3.2. BPF引起肾脏炎症因子表达、巨噬细胞募集与M1/M2极化，以及MMT、EMT和FMT
BPF暴露导致小鼠肾脏炎症相关因子（IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-10、TGF-β1）的mRNA和蛋白表达增加。免疫组化和免疫荧光结果显示，BPF引起了肾脏巨噬细胞（F4/80阳性）浸润，并增强了M1型标志物CD68和M2型标志物CD206的荧光强度，表明巨噬细胞同时向促炎的M1型和促纤维化的M2型极化。进一步研究发现，BPF导致肾脏α-SMA（肌成纤维细胞标志物）荧光强度增强，且α-SMA与CD206共定位增加，提示发生了巨噬细胞-肌成纤维细胞转分化（MMT）。同时，肾小管上皮细胞中E-cadherin（上皮标志物）与α-SMA的荧光强度比值降低，表明发生了上皮-间质转化（EMT）。这些变化共同推动了肾脏纤维化进程。
3.3. BPF暴露激活小鼠肾脏内质网应激
分子对接结果显示，BPF与ER应激关键蛋白PERK、IRE1和ATF-6均能通过氢键结合，且结合能均低于-5 kcal/mol，提示存在较强相互作用。蛋白质相互作用（PPI）网络分析显示了ER应激、巨噬细胞极化、炎症和纤维化相关蛋白之间的关联。蛋白质印迹实验证实，BPF显著上调了肾脏中p-PERK/PERK、p-eIF-2α/eIF-2α、ATF-4、p-NF-κB/NF-κB（PERK通路）以及p-IRE1/IRE1、TRAF2、p-JNK/JNK、ATF-6、TGF-β1（IRE1/JNK和ATF-6通路）的蛋白表达水平，表明BPF全面激活了肾脏的ER应激及相关下游信号通路。
3.4. 4-PBA抑制BPF暴露的Raw264.7细胞中ER应激和巨噬细胞M1/M2极化
体外实验中，40 μM BPF处理48小时可诱导Raw264.7细胞形态向M1/M2极化表型改变，且不影响细胞活力。此条件被选为建立体外模型。使用ER应激抑制剂4-PBA（10 μM）预处理后，BPF诱导的上述ER应激通路蛋白（p-PERK/PERK, p-eIF-2α/eIF-2α, ATF-4, p-NF-κB/NF-κB, p-IRE1/IRE1, TRAF2, p-JNK/JNK, ATF-6, TGF-β1）表达上调均被显著抑制。同时，BPF引起的CD68和CD206荧光强度增强也被4-PBA逆转，表明抑制ER应激可减轻BPF诱导的巨噬细胞M1/M2型极化。
3.5. 抑制Raw264.7细胞的ER应激可减轻BPF诱导的炎症反应以及MMT、EMT和FMT过程
在Raw264.7细胞中，4-PBA干预显著降低了BPF引起的促炎因子（IL-6, TNF-α, IL-1β）和抗炎因子（IL-10, TGF-β1）的mRNA表达和蛋白分泌。此外，BPF处理的Raw264.7细胞在更换无药培养基后仍能持续分泌TGF-β1，而4-PBA干预组此效应减弱。免疫荧光显示，4-PBA减轻了BPF暴露的Raw264.7细胞中α-SMA与CD206的共定位（MMT）。在共培养实验中，与BPF处理的Raw264.7细胞共育后，TCMK-1细胞表现出E-cadherin/α-SMA比值降低（EMT），NIH3T3细胞的α-SMA荧光强度增强（FMT）；而这些变化在4-PBA干预组均得到明显改善。
3.6. 4-PBA抑制BPF暴露小鼠的肾脏ER应激和巨噬细胞M1/M2极化
在体内模型中，4-PBA干预同样显著抑制了BPF引起的小鼠肾脏ER应激通路蛋白（p-PERK/PERK, p-eIF-2α/eIF-2α, ATF-4, p-NF-κB/NF-κB, p-IRE1/IRE1, TRAF2, p-JNK/JNK, ATF-6, TGF-β1）的上调。同时，肾脏巨噬细胞浸润以及CD68和CD206荧光强度的增加也被4-PBA有效抑制。
3.7. 抑制ER应激可减轻BPF暴露小鼠的肾脏炎症和纤维化
4-PBA干预显著降低了BPF暴露小鼠肾脏炎症因子（IL-6, TNF-α, IL-1β, IL-10, TGF-β1）的mRNA和蛋白表达水平。组织病理学显示，4-PBA减轻了肾小球萎缩、肾小管上皮细胞脱落和炎症细胞浸润。免疫荧光和Masson染色结果表明，4-PBA逆转了BPF引起的肾脏α-SMA表达升高、α-SMA与CD206共定位增加、E-cadherin/α-SMA比值下降以及胶原纤维沉积。最重要的是，4-PBA干预显著改善了BPF引起的血清肌酐（SCr）水平升高、体重降低和肾脏系数变化，表明抑制ER应激能够缓解BPF导致的肾功能障碍。
4. 讨论
本研究系统阐明了BPF肾毒性的一个新机制。BPF暴露首先激活肾脏内质网应激，通过PERK/eIF-2α/ATF-4/NF-κB通路促进巨噬细胞向M1型极化，分泌促炎因子（如IL-6、TNF-α），驱动肾脏炎症反应；同时，通过IRE1/TRAF2/JNK和ATF-6通路促进巨噬细胞向M2型极化，分泌大量TGF-β1。TGF-β1作为关键介质，以自分泌和旁分泌方式，诱导巨噬细胞自身发生MMT，并促使肾小管上皮细胞发生EMT、成纤维细胞发生FMT，三者共同导致肌成纤维细胞累积和细胞外基质过度沉积，最终引发肾脏纤维化和功能衰竭。ER应激抑制剂4-PBA在体内外模型中均能有效阻断上述链条式反应，证实了ER应激介导的巨噬细胞极化是BPF诱导肾损伤的核心环节。该研究为理解环境污染物BPF的肾脏危害提供了新的分子视角，并将ER应激与免疫细胞功能紊乱、组织纤维化紧密联系起来，为相关肾脏疾病的防治提供了潜在靶点（如4-PBA）。当然，研究也存在一定局限性，如所用中、高剂量高于典型环境暴露水平，M1巨噬细胞标记物不够特异，4-PBA本身具有多效性等。未来需要更长期的慢性暴露研究、使用更特异的基因敲除或干扰技术，以进一步确证该机制，并评估其在真实世界暴露场景下的意义。
5. 结论
本研究表明，BPF暴露可通过激活内质网应激，介导肾脏巨噬细胞向M1和M2型极化，进而引发炎症反应，并通过MMT、EMT和FMT途径导致肾纤维化，最终造成肾功能障碍。抑制内质网应激可有效缓解上述病理过程。该发现为阐明BPF的肾毒性机制及探索干预策略提供了新的理论依据。
