《Toxics》：Advances in Elucidating the Mitochondrial DNA Mechanisms Underlying Ozone-Induced Inflammation
Qianhui Chen,
Hao Liu,
Junhe Zhou,
Yongjie Wei and
Lingyan He
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这篇综述系统梳理了臭氧(O3)暴露如何通过诱导线粒体损伤与功能障碍，导致线粒体DNA(mtDNA)释放并激活固有免疫应答，从而驱动炎症反应的最新研究进展。文章从臭氧的健康危害、线粒体功能及mtDNA的结构特性入手，重点阐述了mtDNA作为损伤相关分子模式(DAMP)在激活cGAS-STING、TLR9/4-MyD88-NF-κB和NLRP3-ASC-Caspase1等通路中的核心作用，为理解臭氧介导系统性疾病的分子机制提供了新视角。
臭氧暴露的健康危害与线粒体靶向损伤
地表臭氧(O3)是一种公认的主要空气污染物，其对人体多个系统可产生不良健康影响，包括诱发哮喘、心血管事件和中枢神经系统功能障碍等。流行病学和毒理学研究表明，相关系统性疾病的发生常归因于臭氧介导的炎症反应。然而，臭氧本身缺乏触发固有免疫应答的抗原特性，因此，由臭氧暴露诱导的某种中间物质很可能激活了后续的炎症通路。多项研究表明，线粒体DNA(mtDNA)是臭氧诱导线粒体功能障碍过程中释放的一种潜在生物标志物。mtDNA可能作为一种损伤相关分子模式(DAMP)激活固有免疫应答，从而成为连接臭氧与炎症反应的关键环节。
臭氧暴露与线粒体功能的关系
臭氧对健康的负面影响广泛，涉及呼吸、心血管、神经系统，并与全身性疾病死亡率相关。从毒理学角度看，氧化应激和炎症被认为是臭氧致损伤的两个核心机制。线粒体是臭氧诱导细胞损伤的关键靶点，暴露会引发其结构和功能的全面恶化。臭氧诱导过量的活性氧(ROS)产生，压倒线粒体的抗氧化能力，导致脂质过氧化、膜电位崩溃和嵴结构破坏。这些结构改变损害呼吸链复合物和ATP合成，进而影响细胞能量代谢。主流学术观点认为，臭氧的毒性效应是通过其渗入肺部后产生的某些活性分子实现的。近期研究揭示了线粒体及mtDNA的关键作用。在臭氧诱导的支气管炎症中，线粒体功能障碍是气道重塑的驱动因素。直接急性臭氧暴露也会诱导小鼠mtDNA释放，激活cGAS-STING信号通路及随后的炎症反应。
线粒体DNA(mtDNA)的结构与功能
线粒体是细胞内的主要产能单元，也是调控细胞增殖、凋亡等重要功能的细胞器。人类线粒体拥有独特的mtDNA，它是一种环状双链DNA，包含16,569个碱基对。mtDNA可以转录多种产物，参与线粒体内及细胞质内的众多生化反应。它包含37个基因，编码22个tRNA、2个rRNA和13个蛋白质。最近的研究发现，mtDNA还能编码第14种蛋白质，并在细胞质中翻译，在早期发育中起关键作用。此外，mtDNA衍生的RNA也可被输出线粒体，参与多种生理病理过程。
细胞内mtDNA的功能特性包括其拷贝数与丰度、异质性以及线粒体动力学的关系。mtDNA的丰度在不同组织间存在差异，但整体相对稳定。其拷贝数可作为线粒体功能障碍的生物标志物。例如，研究已证实臭氧暴露会损伤线粒体，导致人外周血中mtDNA拷贝数增加。由于缺乏组蛋白保护，mtDNA极易发生突变。细胞中不同mtDNA变体的共存被称为mtDNA异质性。当异质性频率超过阈值时，会导致线粒体功能障碍。线粒体通过频繁的分裂与融合实现自我复制与更新，这一形态变化过程称为线粒体动力学。近期证据表明，线粒体动力学与mtDNA拷贝数的维持、损伤修复和突变传递密切相关。
mtDNA在臭氧暴露中的作用
臭氧是一种强氧化剂，可与生物体内的各种生物分子相互作用，产生大量ROS，进而损伤脂质、蛋白质和DNA等有机大分子。线粒体作为细胞内ROS产生的主要场所，其内部的mtDNA由于独特定位，在氧化应激下易直接受到ROS攻击，导致氧化、修饰和断裂。羟基自由基可将鸟嘌呤转化为8-羟基脱氧鸟苷(8-OH-dG)，在mtDNA复制时可能错误配对。ROS还可直接攻击mtDNA的脱氧核糖骨架，导致链断裂，损害mtDNA完整性。臭氧和ROS对蛋白质的氧化修饰也会损害mtDNA的复制和修复机制。总之，臭氧暴露对mtDNA产生不利影响，导致其氧化、突变和断裂。
被释放的mtDNA来源与细菌DNA有相似之处，可作为重要的损伤相关分子模式(DAMP)。当mtDNA进入细胞质或细胞外基质时，可被模式识别受体(PRRs)识别，从而在无感染情况下激活固有免疫反应和炎症。mtDNA的释放需要通过特定机制介导的主动调控过程或被动的意外途径。主要包括以下四种机制：
- 1.
mPTP介导的mtDNA释放：线粒体通透性转换孔(mPTP)是由电压依赖性阴离子通道(VDACs)、腺嘌呤核苷酸转位酶(ANT)和亲环蛋白D(CyD)组成的超分子结构。臭氧和ROS诱导的脂质和膜蛋白氧化损害线粒体膜功能和完整性，最明显的表现之一是线粒体膜电位下降，进而触发mPTP开放。随后的线粒体钙超载加剧mPTP开放，导致基质肿胀、膜电位崩溃，最终触发细胞死亡。在多种细胞中，mPTP的激活促进了mtDNA片段释放到细胞质中。
- 2.
BAK/BAX介导的mtDNA释放：Bax和Bak是Bcl-2蛋白家族的促凋亡成员。在凋亡信号刺激下，其构象发生变化，通过多个α-螺旋结构域插入线粒体外膜形成寡聚体和多聚体复合物，从而在膜上形成大孔。在持续刺激下，这些大孔加深并延伸至线粒体内膜；mtDNA核区可通过形成的Bak/Bax孔释放到细胞质中。
- 3.
异常线粒体动力学介导的mtDNA释放：外部刺激包括臭氧暴露会破坏线粒体分裂与融合的动态平衡。在ROS的氧化应激下，mtDNA发生氧化，导致突变或断裂。氧化修饰或钙内流可能异常激活复制相关酶，最终在异常线粒体分裂期间触发mtDNA复制应激。
- 4.
线粒体源性囊泡(MDVs)介导的mtDNA释放：MDVs是一类起源于线粒体的特殊囊泡，在 mitochondrial quality control 和信号转导中起关键作用。研究表明，mtDNA片段可通过MDVs释放到细胞质中，这一过程独立于线粒体自噬或分裂过程。在响应线粒体应激时，含有mtDNA的核样体会被选择性地转移到这些囊泡中。
被释放的mtDNA诱导炎症反应
由于其细菌起源以及存在低甲基化的CpG序列，mtDNA作为线粒体释放的DAMP，是固有免疫反应的强力触发因子。研究表明，mtDNA可通过与Toll样受体9(TLR9)、NOD样受体家族pyrin域包含蛋白3(NLRP3)和cGAS-STING通路等模式识别受体(PRRs)相互作用来诱导炎症反应。
臭氧暴露诱导mtDNA释放并激活下游炎症通路的机制如下图所示：
- 1.
cGAS-STING通路：cGAS-STING通路主要由环鸟苷酸-腺苷酸合成酶(cGAS)和干扰素基因刺激因子(STING)组成。细胞质中的cGAS可有效识别并结合双链DNA(dsDNA)，从而启动其催化活性以产生环鸟苷酸-腺苷酸(cGAMP)。cGAMP作为内源性信号分子，激活位于内质网的STING受体，导致TANK结合激酶1(TBK1)和干扰素调节因子3(IRF3)磷酸化，最终介导干扰素刺激基因(ISGs)和I型干扰素(IFN-I)的转录。IFN-I的上调促进肿瘤坏死因子α(TNF-α)上调，从而增强炎症反应。同时，STING也能刺激NF-κB信号级联反应，促进促炎细胞因子的合成。现有证据表明，直接臭氧暴露可诱导mtDNA释放，从而激活cGAS-STING信号通路，并参与结膜炎的发病机制。
- 2.
TLR9/4-MyD88-NF-κB通路：TLR9是第一个被报道识别未甲基化CpG-DNA的受体。对于TLR4，尽管没有直接证据支持其识别游离mtDNA片段的能力，但研究表明mtDNA损伤常伴随TLR4激活。两者都是I型跨膜蛋白，其胞内域具有Toll/IL-1受体(TIR)结构域，便于与髓样分化因子88(MyD88)等下游衔接蛋白相互作用，从而启动后续信号级联。TLR9识别未甲基化CpG序列后，被转移至内体，募集MyD88并激活IRAK，导致NF-κB去磷酸化。释放的NF-κB随后易位至细胞核发挥其生物学功能，从而上调pro-IL-1β和pro-IL-18的表达。TLR4同样募集MyD88来调节下游信号通路。
- 3.
NLRP3-ASC-Caspase1通路：另一个与mtDNA释放密切相关的炎症反应是核苷酸结合寡聚化域(NOD)样受体的激活。NLRP3炎性体是一个由NLRP3传感器蛋白、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)和pro-caspase-1组成的细胞质多蛋白复合物。当氧化的线粒体DNA(Ox-mtDNA)存在于细胞质中时，它被激活并组装成功能完整的NLRP3炎性体。与上述通路不同，NLRP3表现出更强的识别氧化mtDNA的倾向，这表明ROS在NLRP3炎性体激活中起着关键作用。值得注意的是，除了作为mtDNA释放的下游信号外，NLRP3还通过促进VDAC寡聚化和打开钙依赖性mPTP通道进行上游调节，从而释放片段化的Ox-mtDNA并增加ROS产生。这些泄漏的氧化mtDNA进一步促进NLRP3激活，加剧炎症反应。在许多臭氧暴露实验中，NLRP3炎性体的激活经常被确定为一个重要的上游炎症因子，通常与线粒体功能受损和ROS积累有关。
臭氧暴露、mtDNA与炎症反应的调控关系
臭氧暴露诱导氧化应激，损害线粒体膜，导致mtDNA释放到细胞质和细胞外空间。一旦释放，mtDNA作为DAMP激活多种固有免疫信号通路。在细胞质中，mtDNA与cGAS结合，通过TBK1-IRF3信号通路激活STING通路，产生I型干扰素。同时，细胞外mtDNA通过未甲基化的CpG基序激活TLR9或TLR4，触发MyD88依赖的NF-κB激活和促炎细胞因子转录。此外，氧化的mtDNA(ox-mtDNA)片段直接结合NLRP3炎性体，募集ASC并激活caspase-1以切割pro-IL-1β和pro-IL-18，最终诱导细胞焦亡。这些并行的信号级联建立了强大的炎症反应，介导臭氧诱导的肺部及全身器官组织损伤。
结论
目前，关于臭氧暴露的研究仍相对有限。流行病学证据表明，臭氧暴露与多种神经、呼吸和心血管疾病风险增加相关，且常伴有炎症标志物升高和线粒体功能障碍。现有关于臭氧暴露的研究在线粒体DNA拷贝数和动力学方面提供了重要发现，并探索了涉及mtDNA的下游通路激活机制，如NLRP3炎性体和NF-κB通路，提示mtDNA在这些过程中可能扮演关键角色。虽然实验证据尚不完整，但新出现的迹象表明，臭氧暴露可通过释放mtDNA作为危险相关分子模式(DAMP)来诱导结膜炎，从而激活cGAS-STING信号通路。通过整合现有的臭氧流行病学分析、毒理学数据以及全面的ROS机制研究，我们确认mtDNA是连接体内臭氧暴露与炎症的关键分子。其释放可能作为一种DAMP——一种固有免疫信号，促进包括cGAS-STING、TLR9/4-MyD88-NF-κB和NLRP3-ASC-Caspase1在内的通路。
然而，必须承认，目前相关毒理学实验的数量仍不足以确定在臭氧暴露条件下mtDNA下游激活的具体途径。此外，还需要进一步的实验验证来阐明mtDNA如何从线粒体中释放，以及其随后是作为自由漂浮分子存在于细胞质中还是作为细胞外实体存在。这将极大地增进我们对臭氧暴露内在机制的理解，并有助于建立更精确的臭氧内暴露-反应关系。
