《Breast Cancer: Targets and Therapy》：Development of a Prognostic Stratification Model and Identification of BDH1 as an Oncoprotein in Breast Cancer Based on Subcluster-Specific Markers of B-Cell Subsets
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本文整合单细胞RNA测序（scRNA-seq）与批量转录组数据，通过机器学习（LASSO-Cox）构建了基于B细胞亚群特异性标志物（SSMs）的乳腺癌（BC）预后风险模型。模型包含四个核心基因（IGJ, CD79A, MS4A1, HLA-DOB），可有效区分高/低风险患者。研究进一步鉴定出BDH1、CDK5等多个高危患者潜在治疗靶点，其中3-羟基丁酸脱氢酶1（BDH1）在BC中高表达且与不良预后相关，并证实药物维甲酸（tretinoin）可通过靶向BDH1抑制BC细胞的恶性生物学行为，为个体化治疗提供了新策略。
分析乳腺癌肿瘤微环境基于单细胞RNA测序数据
本研究首先从EMBL-EBI数据库获取了乳腺癌（BC）的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据，通过分析鉴定出24个主要细胞簇，进而注释为10种主要细胞类型。对其中B细胞、T细胞、单核细胞和上皮细胞进行重聚类分析，最终得到35个细胞亚群。拷贝数变异（CNV）分析显示，与B细胞相比，上皮细胞亚群在多条染色体上存在扩增和缺失。
基于B细胞亚群特异性标志物识别乳腺癌预后相关聚类
研究共鉴定出2004个亚群特异性标志物（SSMs）。利用基因集变异分析（GSVA）对训练集（TCGA队列，1039个肿瘤样本）中不同细胞亚群的富集情况进行评分和量化。通过单因素Cox回归模型筛选，发现六个B细胞亚群与患者预后显著相关。基于这六个亚群的53个SSMs（编码蛋白），对训练集样本进行一致性聚类分析，得到两个聚类。生存分析表明，聚类1患者的生存时间长于聚类2患者，该结果在GSE88770和GSE20685验证集中得到重复。
基于机器学习的风险模型构建
从53个SSMs中，通过单因素Cox回归分析鉴定出16个预后基因。随后，在训练集中对这16个基因进行LASSO回归（10折交叉验证），最终筛选出四个关键基因（IGJ, CD79A, MS4A1, HLA-DOB），并以此构建了多因素Cox回归风险模型。根据风险评分中位数将样本分为高、低风险组。在训练集和所有验证集（GSE20685, GSE42568, GSE88770）中，高风险组患者的总体生存时间均显著短于低风险组。时间依赖性受试者工作特征（ROC）曲线显示，该模型对患者1年、3年和5年生存期具有良好的预测性能。此外，单因素COX回归分析表明，风险评分是所有数据集中乳腺癌患者预后的预测因子。
风险分组的免疫微环境分析
通过单样本基因集富集分析（ssGSEA）计算训练集样本中28种免疫细胞的浸润水平。结果显示，除中央记忆CD8+T细胞外，高风险组中所有免疫细胞的浸润水平均显著低于低风险组。癌症免疫周期（CIC）评分分析表明，高风险组所有步骤的活性均显著低于低风险组。免疫调节剂表达分析结果显示，高风险组大多数免疫调节剂的表达也显著降低。通路相关性分析发现，PROGENy通路中的NF-κB、TNF-α和TRAIL活性与风险评分呈显著负相关，而VEGF与风险评分呈显著正相关。Hallmark通路中的同种异体移植排斥、补体、IL2-STAT5信号、IL6-JAK-STAT3信号、炎症反应、干扰素γ反应、KRAS信号上调和TNFα信号通过NF-κB等与风险评分呈显著负相关。
药物敏感性分析与潜在药物靶点筛选
基于癌症治疗反应门户（CTRP）和癌症基因组计划（CGP2016）数据库，筛选出11种与风险评分显著负相关的化合物，其半数抑制浓度（IC50）在高风险组中均较低。通过分析可成药靶点表达与风险评分的相关性，以及计算RNAi和必需性评分（CERES）与风险评分的相关性，最终筛选出6个共有的潜在靶点：BDH1、细胞周期蛋白依赖性激酶5（CDK5）、组蛋白去乙酰化酶11（HDAC11）、NADH:泛醌氧化还原酶核心亚基S8（NDUFS8）、孕酮受体（PGR）和溶质载体家族2成员1（SLC2A1）。这六个基因的表达与风险评分呈显著正相关，而其CERES评分与风险评分呈显著负相关。
药物靶点表达特征与潜在小分子药物分析
利用GEPIA数据库进一步分析六个靶点的表达及预后价值，结果显示除PGR外，其余五个基因在BC肿瘤组织中均显著上调。其中，只有BDH1的表达与患者生存时间显著相关。通过NetworkAnalyst数据库分析针对这五个高表达基因的潜在药物，发现维甲酸（tretinoin）和丙戊酸（valproic acid）可靶向其中四个靶点。分子对接进一步验证了药物与靶点的结合，结果显示维甲酸与所有五个靶点均具有良好的结合活性（亲和力 < -5 kcal/mol）。细胞热位移分析（CETSA）表明，与DMSO相比，维甲酸能在更高温度下稳定MCF-7和MDA-MB-231细胞中的BDH1，提示两者存在直接结合。
BDH1在乳腺癌中高表达并促进恶性行为
人类蛋白质图谱（HPA）数据库显示，BDH1在导管癌和小叶癌中均高表达，且BDH1高表达患者的总体生存时间更短。UALCAN数据库数据也证实BDH1在BC组织中的表达显著高于正常对照组。与人永生化乳腺细胞MCF-10A相比，BDH1在多种BC细胞系中高表达，其中在MCF-7和MDA-MB-231细胞中表达最高。通过构建BDH1敲低细胞系，研究发现敲低BDH1可显著抑制BC细胞活力、促进细胞凋亡。Western blot检测上皮-间质转化（EMT）相关蛋白表达发现，BDH1敲低后，N-钙粘蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）的表达降低，而上皮钙粘蛋白（E-cadherin）的表达升高。
维甲酸通过靶向BDH1抑制乳腺癌细胞恶性行为
CCK-8实验确定维甲酸对BC细胞活力的影响呈剂量依赖性抑制，并计算出其对MCF-7和MDA-MB-231细胞的IC50值分别为45.05 μM和56.73 μM，后续实验选用50 μM浓度。研究发现，维甲酸处理可显著抑制BDH1的转录水平。功能实验表明，维甲酸能显著抑制BC细胞活力、促进细胞凋亡，并逆转EMT表型（降低N-cadherin和Vimentin，升高E-cadherin）。而过表达BDH1则可以逆转维甲酸对BC细胞恶性行为的抑制作用。为评估维甲酸的体内抗肿瘤特性，在BALB/c裸鼠中建立了BC异种移植模型。结果显示，维甲酸治疗能显著减缓移植瘤生长、降低肿瘤重量，而过表达BDH1则能逆转维甲酸的抗癌效果。
结论
本研究构建了一个基于B细胞亚群特异性标志物的乳腺癌预后风险模型，该模型对于评估乳腺癌患者的临床结局具有应用前景。研究鉴定出BDH1是高风险患者的重要药物靶点，并证实维甲酸可通过靶向BDH1抑制乳腺癌细胞的恶性表型，这为使用维甲酸临床治疗高风险乳腺癌患者提供了理论基础。
