《Cancer Management and Research》：Inhibition of CDK1 Promotes Immunogenic Cell Death in Neuroblastoma
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这项研究揭示，抑制细胞周期蛋白依赖性激酶1 (CDK1) 不仅能减缓高CDK1表达的神经母细胞瘤 (NB) 的进展，还能通过诱导免疫原性细胞死亡 (ICD) 触发损伤相关分子模式 (DAMP) 释放，从而重塑肿瘤免疫微环境，增强抗肿瘤免疫反应，为改善NB的免疫治疗疗效提供了新策略。
背景
神经母细胞瘤 (Neuroblastoma, NB) 是儿童最常见的颅外实体肿瘤，起源于神经嵴细胞。其生物学和临床特征具有高度异质性，肿瘤可能自发消退，也可能广泛扩散和转移。低危和中危的NB患者可以通过手术切除联合或不联合化疗治愈，而高危NB患者即使在接受多种高强度联合疗法后，5年生存率也仅约50%。免疫疗法在血液肿瘤、肺癌和黑色素瘤等其他实体瘤中显示出显著疗效，这为高危NB的治疗提供了有希望的方向。然而，NB利用多种免疫逃逸机制，如下调MHC I类分子表达，抑制T细胞介导的细胞毒性和NK细胞功能，使得免疫治疗在NB中的应用面临挑战。
高风险的NB细胞突变负荷相对较低，因此MHC I类分子呈递途径呈现的肿瘤相关抗原较少，导致肿瘤细胞的抗原性较弱。这种弱抗原性也阻止了肿瘤周围淋巴结中的抗原呈递细胞 (APCs) 有效激活特异性杀伤肿瘤的免疫细胞，包括CD8+T细胞、Th1细胞和巨噬细胞。因此，肿瘤的免疫原性，即肿瘤抗原物质诱导宿主免疫反应的能力，在NB中较低，这是其微环境中缺乏免疫细胞的重要原因，也是导致免疫治疗效果不佳的主要因素。
研究发现，某些细胞毒药物不仅能促进肿瘤细胞死亡，还能促进损伤相关分子模式 (damage-associated molecular patterns, DAMPs) 的释放，并诱导免疫原性细胞死亡 (immunogenic cell death, ICD)。DAMPs包括细胞表面的钙网蛋白 (Calreticulin, CRT)、肿瘤细胞分泌的高迁移率族蛋白1 (High mobility group protein 1, HMGB1)、从细胞释放的ATP分子以及热休克蛋白 (HSP70, HSP90) 等。这些DAMPs在ICD过程中释放出来，可以与树突状细胞 (Dendritic Cells, DCs) 表面的模式识别受体 (pattern recognition receptors, PRRs) 结合，启动一系列细胞反应，最终激活先天性和适应性免疫应答。肿瘤细胞的免疫原性死亡可促进DC细胞成熟，并招募和激活CD8+T细胞的免疫反应，从而产生肿瘤杀伤效应，这使其成为肿瘤免疫治疗的研究热点。
细胞周期蛋白依赖性激酶1 (Cyclin-dependent kinase 1, CDK1) 是CDK家族中第一个被发现的成员，调节G2期到M期的转换。CDK1在多种肿瘤中过表达，并参与肿瘤细胞增殖过程。研究表明，CDK抑制剂可以诱导肿瘤细胞的ICD，进而激活免疫细胞，从而增强CDK抑制剂的抗肿瘤功效。然而，CDK1在神经母细胞瘤中的功能以及CDK1抑制剂的抗肿瘤功效仍不清楚，需要进一步研究。RO-3306是一种特异性、可逆的CDK1抑制剂，其激酶选择性已通过细胞实验得到验证。本研究的目的是探讨CDK1在NB中的作用及其作为免疫治疗靶点的潜力。
结果
1. CDK1过表达与神经母细胞瘤患者预后不良相关
研究首先利用TCGA数据库和R2平台分析了CDK1的mRNA表达水平。结果显示，CDK1在多种癌症组织中高表达，且在NB中，其表达水平随着疾病分期进展而升高。研究者还利用组织芯片检测了CDK1在NB中的表达，发现III–IV期NB患者组织中CDK1的表达水平高于I-II期患者。此外，在伴有MYCN基因扩增的NB中，CDK1表达水平也显著更高。预后分析表明，CDK1高表达的NB患者，其无事件生存期和总生存期均比CDK1低表达的患者更差。这些结果提示，CDK1高表达与神经母细胞瘤的不良预后相关。
2. CDK1的表达与免疫原性和效应免疫细胞浸润呈负相关
为了探究CDK1对免疫细胞的影响，研究者分析了CDK1表达与免疫原性相关基因的关系。数据显示，CDK1高表达的NB具有较低的免疫评分，表明其免疫细胞浸润程度较低。同样，CDK1高表达也与较低的基质评分相关。ESTIMATE评分也显示，CDK1过表达的NB可能具有较低的免疫原性和免疫抑制性的微环境。反之，CDK1表达与肿瘤纯度呈正相关。此外，对免疫细胞浸润的分析发现，CDK1表达与DCs（特别是活化的DCs）的浸润呈弱负相关，这可能表明CDK1限制了抗原呈递。CD8+T细胞和NK细胞在肿瘤微环境 (Tumor Microenvironment, TME) 中的浸润数量也与CDK1表达呈负相关。同时，在CDK1高表达的NB中，活化的CD4+T细胞多于记忆性CD4+T细胞。这些结果综合表明，CDK1在NB中与免疫原性和效应免疫细胞的浸润呈负相关。
3. CDK1的表达与效应细胞因子的表达呈负相关
细胞因子在肿瘤微环境中扮演重要角色，可调节免疫细胞的成熟、分化和增殖。研究者分析了CDK1表达与几种细胞因子的相关性。CDK1与IL-12、IRF1和IFN-γ的表达呈负相关，这三种细胞因子是抗肿瘤免疫中的关键效应因子。然而，它与TNF和IL-2的相关性在统计学上不显著。此外，CDK1与IL-4的表达呈微弱的正相关，而IL-4通常与免疫抑制性的Th2反应相关。这些结果表明，CDK1可能通过抑制有效细胞因子并促进免疫抑制性细胞因子的产生，从而在NB中形成免疫抑制性的肿瘤微环境。
4. 抑制CDK1减缓神经母细胞瘤细胞生长
为了探究CDK1在神经母细胞瘤进展中的作用，研究者在MYCN扩增的SKNBE细胞系和非扩增的SKNSH细胞系中使用了CDK1抑制剂RO-3306。蛋白质印迹和qPCR结果证实，CDK1在SKNBE细胞系中的表达（mRNA和蛋白水平）高于SKNSH细胞系。在使用抑制剂处理后，SKNBE细胞对药物表现出比SKNSH细胞更高的敏感性。实验结果显示，CDK1抑制剂以浓度依赖性的方式诱导SKNBE和SKNSH细胞发生凋亡。由于CDK1是细胞周期中的关键蛋白，其抑制导致SKNBE和SKNSH细胞的细胞周期停滞在G2/M期，尤其是在25 μM的RO-3306浓度下效果显著。迁移和侵袭实验表明，RO-3306显著抑制了SKNBE和SKNSH细胞的迁移和侵袭能力，在25 μM浓度下，几乎没有细胞迁移到下室。集落形成实验也证实，抑制CDK1显著抑制了细胞的克隆形成能力。这些结果表明，抑制CDK1可以诱导神经母细胞瘤细胞功能障碍，从而抑制其进展。
5. 抑制CDK1促进神经母细胞瘤的免疫原性细胞死亡
观察到CDK1抑制诱导了神经母细胞瘤细胞死亡，且CDK1表达与免疫细胞浸润相关，这提示CDK1抑制剂可能诱导免疫原性细胞死亡。流式细胞术分析发现，在不同浓度的RO-3306孵育后，SKNBE和SKNSH细胞膜上的钙网蛋白 (CRT) 和HSP70的水平显著增加。免疫荧光检测进一步验证了这些结果，显示RO-3306干预诱导了CRT在细胞膜上的暴露。类似地，通过激光共聚焦显微镜检测发现，SKNBE和SKNSH细胞膜上HSP70的表达也显著增加。此外，RO-3306处理后，HMGB1的分泌显著增加，导致细胞核内HMGB1的减少。这些结果共同表明，抑制CDK1可以促进神经母细胞瘤细胞的免疫原性细胞死亡。
6. 抑制CDK1减缓体内肿瘤生长并增强抗肿瘤免疫反应
为了更严谨地评估CDK1对神经母细胞瘤生长的影响，研究者使用Neuro-2a细胞在BALB/c小鼠中建立了皮下移植瘤模型。与对照相比，尾静脉注射CDK1抑制剂RO-3306显著降低了肿瘤的体积和重量。组织化学染色显示，RO-3306处理组中Ki67（增殖标志物）水平降低，表明RO-3306有效抑制了肿瘤细胞的增殖。利用流式细胞术评估免疫细胞表型和功能发现，RO-3306处理后，CD11c+CD80+CD86+的成熟树突状细胞 (DCs) 比例显著升高，表明未成熟DC向成熟DC的转化率增加。同时，观察到RO-3306处理组中F4/80+CD206+细胞（M2型巨噬细胞）的浸润减少，表明RO-3306降低了M2巨噬细胞群。此外，CD3+CD8+T细胞的比例增加，而CD3+CD4+T细胞的比例下降。这种转变可能是由于成熟DC呈递肿瘤抗原，从而增强了T细胞介导的抗肿瘤免疫。重要的是，体内实验也发现，CDK1抑制后，肿瘤组织中钙网蛋白 (CRT) 表达显著上调，而细胞核内HMGB1水平显著降低，这与体外实验结果一致。
讨论
神经母细胞瘤是起源于儿童交感神经系统的恶性实体肿瘤。与成人恶性肿瘤不同，儿童NB的基因突变较少，这使得免疫检查点疗法在NB治疗中仍然受到严重限制。高风险NB组的儿童免疫微环境受到显著抑制，表现为免疫“冷”肿瘤，具有多种免疫逃逸策略。高风险NB细胞的突变负荷相对较低，因此MHC I类分子呈递的肿瘤相关抗原较少，导致肿瘤细胞抗原性较弱。因此，寻找激活针对神经母细胞瘤的免疫反应的方法成为改善免疫治疗的关键。
本研究发现CDK1在NB中高表达，并与不良预后相关。抑制CDK1可促进肿瘤细胞凋亡，并抑制肿瘤细胞的增殖和迁移，这与之前的报告一致。然而，关于CDK1调节神经母细胞瘤免疫微环境的研究目前尚缺乏。本研究首次探讨了CDK1与神经母细胞瘤中免疫细胞的相关性，发现CDK1的表达与免疫细胞功能相关，并揭示了其在调节免疫微环境中的潜在作用。其具体调控机制有待进一步研究。
本研究主要关注ICD在神经母细胞瘤中的作用以及CDK1抑制作为治疗策略的潜力。ICD是一种受调控的细胞死亡形式，可促进DAMPs的释放，这些分子有助于DC成熟和激活对癌症免疫治疗至关重要的免疫反应。除了其在细胞周期进程中的既定作用外，本研究的数据揭示了CDK1在神经母细胞瘤中一个先前未被充分认识的免疫调节功能。通过使用选择性CDK1抑制剂RO-3306，研究者观察到CDK1抑制诱导了与免疫原性细胞死亡相关的标志性分子特征，包括细胞表面钙网蛋白 (CRT) 的暴露、HSP70的上调和HMGB1的分泌。这些DAMPs已知可促进树突状细胞成熟和抗原呈递。重要的是，这些体外发现伴随着体内肿瘤免疫微环境的显著重塑：CDK1抑制增加了成熟树突状细胞和CD8+T细胞的浸润，同时减少了免疫抑制性M2巨噬细胞的比例。这种从“冷”免疫状态向更“热”免疫状态的转变表明，抑制CDK1可能有助于克服神经母细胞瘤的免疫逃逸。
这项研究证实，CDK1可以作为调节NB免疫微环境和增强免疫治疗的可行靶点。使用RO-3306抑制CDK1不仅通过增加成熟树突状细胞和CD8+T细胞的比例改变了免疫格局，还减少了M2巨噬细胞的存在。树突状细胞在激活和启动CD8+T细胞中起着至关重要的作用，它们的成熟增强了T细胞介导的肿瘤免疫。本研究的另一个关键观察是CDK1抑制后M2样巨噬细胞的减少。神经母细胞瘤中的肿瘤相关巨噬细胞主要是M2极化的，并有助于免疫抑制、血管生成和治疗抵抗。从M2主导表型的转变表明，CDK1抑制不仅可以促进免疫原性死亡相关信号，还可能通过减轻骨髓来源的抑制作用来重编程肿瘤微环境。这种作用是直接的（例如，通过巨噬细胞中的CDK1活性）还是间接的（例如，继发于T细胞衍生的细胞因子）仍然未知，代表了未来使用谱系特异性遗传模型进行机制研究的一个重要方向。
研究者认识到本研究存在一个关键局限：虽然DAMPs的释放和随后的免疫重塑与ICD一致，但还不足以最终确定其发生。根据该领域的既定共识，确定ICD需要证明，在免疫活性宿主中，用濒死的肿瘤细胞进行疫苗接种能对随后的肿瘤攻击提供保护性免疫。此外，区分免疫依赖性和免疫非依赖性的抗肿瘤效应需要进行CD8+T细胞耗竭或在免疫缺陷小鼠模型中进行疗效研究。尽管RO-3306被广泛认为是选择性CDK1抑制剂，但不能完全排除潜在的脱靶效应。为了严格解决这个问题并确保选择性抑制CDK1，研究者使用了一系列与已发表文献一致的低浓度在内的浓度范围。这种方法最大限度地减少了来自脱靶激酶的潜在混杂效应，同时有效靶向CDK1。先前的研究已证实，RO-3306在有效浓度下抑制CDK1，并且其激酶选择性已通过表型和生化分析得到验证。未来的研究将需要使用基因沉默技术（例如siRNA、CRISPR/Cas9或救援实验）来进一步确认其在神经母细胞瘤中的CDK1特异性作用。
总之，本研究结果证实，CDK1是调节神经母细胞瘤免疫微环境和增强免疫治疗的一个有前景的靶点。通过诱导符合ICD特征的DAMPs释放，抑制CDK1不仅能减缓肿瘤进展，还能刺激免疫反应，从而使CDK1成为神经母细胞瘤的潜在预后标志物和治疗靶点。
