《Agronomy》：Detection and Characterization of Plum Pox Virus (Potyvirus plumpoxi) Marcus Strains in Spanish Apricot and Peach Orchards Through RNA-Seq Analysis
Lucía Rodríguez-Robles,
Pedro J. Martínez-García,
Pedro Martínez-Gómez and
Manuel Rubio
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本研究利用高通量RNA测序（RNA-Seq）技术，对西班牙商业桃园和杏园中表现严重痘病毒（Sharka）症状的样品进行病毒筛查与分子特征分析，成功检测出包括高致病性李痘病毒（Potyvirus plumpoxi, PPV）Marcus毒株（PPV-M）在内的共10种病毒。研究通过单核苷酸变异（SNV）分析揭示了PPV-M种群的基因组变异特征，并结合系统发育分析探讨了其欧洲起源与传播路径。结果证实了PPV-M在西班牙果园的再次流行，为加强植物种苗认证与植物检疫控制措施提供了关键的分子流行病学证据。
引言
核果（Prunus）属的栽培品种在全球范围内具有重要的经济价值，但其产量和果实品质常受到病毒病的严重威胁。其中，由李痘病毒（Potyvirus plumpoxi, PPV）引起的“痘病”（Sharka）是影响最严重的病害之一。PPV存在多种毒株，其中Dideron型（PPV-D）毒株传播较广但侵袭性较弱，而Marcus型（PPV-M）毒株则更为激进，可导致桃、杏、李的快速流行病。在西班牙，PPV-M于2004年首次在阿拉贡地区被检测并根除，但近年来该毒株再度出现。混合病毒感染在自然界中很常见，因此，以高通量测序（HTS）为代表的先进分子工具，如RNA测序（RNA-Seq），成为了在自然栖息地中进行病毒筛查、同时检测多种病原体的关键技术。本研究旨在利用基于Illumina平台的RNA-Seq技术，对表现出严重痘病症状的商业桃园和杏园进行植物病毒筛查，并对检测到的侵袭性PPV-M毒株进行深入的基因组学和系统发育学分析。
材料与方法
2.1. 植物材料与RNA提取
研究从位于西班牙阿拉贡、加泰罗尼亚和穆尔西亚地区的九个商业桃园以及加泰罗尼亚的一个商业杏园采集了叶片样品。所有样品均表现出典型的痘病症状。叶片组织在RNALater溶液中保存，液氮研磨后，使用商业试剂盒提取总RNA，并利用特异性引物进行RT-PCR验证，最终筛选出五个明确感染PPV-M的样品进行RNA-Seq分析。这五个样品包括三个来自阿拉贡的桃（ARA1, ARA2, ARA3）、一个来自加泰罗尼亚的杏（CAT1）和一个来自穆尔西亚的桃（MUR1）。
2.2. RNA-Seq文库构建与测序
从总RNA出发，使用商业试剂盒去除核糖体RNA序列并富集信使RNA，构建了15个测序文库（5个样品×3个重复）。测序在Illumina NovaSeq平台上进行，采用双端测序（2 × 150 bp），平均每个样本产生约5200万条原始读长。
2.3. RNA-Seq生物信息学分析
原始测序数据经过去除接头和低质量序列的质控。随后，将高质量读长比对到桃和杏的宿主参考基因组，并移除比对上的读长以去除宿主序列。剩余的“非宿主”读长被用于病毒分析。通过de novo组装（使用Trinity）得到contigs，并将其与从NCBI数据库中提取的已知侵染Prunus属的病毒基因组数据库进行BLASTn比对，以鉴定病毒。比对结果按一定阈值（如E值<1×10-5）进行过滤。基于病毒读长计数进行主成分分析（PCA）以评估样品和重复间的相似性。
2.4. RT-PCR病毒检测验证
通过针对PPV-D和PPV-M的特异性RT-PCR实验，验证了RNA-Seq分析所使用叶片样品的病毒感染状态，确认了所有样品均感染PPV-M，而非PPV-D。
2.5. 李痘病毒（Marcus毒株）的单核苷酸变异分析
将样品组装的contigs与PPV-M参考基因组进行比对，并使用SAMtools和BCFtools鉴定单核苷酸变异（SNV），分析其在不同基因组区域（如编码区）的分布和突变率。
2.6. 系统发育分析
利用检测到的SNV，为每个研究的样本生成一致的共识序列。随后构建了两个系统发育树：第一个包括本研究的样本与不同的PPV毒株；第二个则专注于PPV Marcus毒株，并纳入来自多个国家的PPV-M分离株。使用邻接法构建系统发育树。
结果
3.1. RNA-Seq数据处理与病毒鉴定
测序平均产生约5266万条原始读长，经质控后保留约96%的高质量读长。在去除比对到宿主基因组的读长后，剩余的非宿主读长被用于病毒鉴定。De novo组装产生的contigs平均长度约为1000个核苷酸。通过比对分析，在Prunus样品中共检测到10种不同的病毒，包括李痘病毒Marcus毒株（PPV-M）、油菜花叶病毒、油桃茎陷洞相关病毒（NSPaV）、桃相关黄症病毒（PaLV）等。其中，PPV-M在所有分析的样本中均被检测到，并且在大部分样本中表现出超过99.5%的基因组覆盖度和高于2000×的平均测序深度，表明其在宿主中具有高复制活性和广泛分布。PCA分析显示生物学重复聚类良好，支持了病毒检测和丰度估计的稳健性。
3.2. 单核苷酸变异（SNV）分析
在分析的PPV-M基因组中，共检测到330个独特的单核苷酸变异。每个样本的SNV数量在158到186个之间。这些变异主要是碱基转换（~85%），其中U?C和A?G最为常见。PPV-M基因组（9786 nt）的整体突变率约为1.77%。突变率在不同基因组区域有所差异，其中NIa-Pro和P1-Pro是变异最高的区域，而6K2、VPg和CI区域相对保守。
3.3. 系统发育分析
系统发育分析显示，本研究的样本与PPV-M参考毒株聚为一类。在包含不同PPV毒株的系统发育树中，研究的样本形成了一个独立的进化枝，其中来自阿拉贡-加泰罗尼亚边境地区的三个样本（CAT1, ARA2, ARA3）聚在一起，而来自阿拉贡中部（ARA1）和穆尔西亚（MUR1）的样本则形成了另一组。在与国际PPV-M分离株的比较中，本研究的样本与来自意大利、罗马尼亚和日本的分离株以及一个土耳其分离株（埃迪尔内地区）表现出较近的亲缘关系，暗示了潜在的植物材料交换路径。特别是，ARA1和MUR1与意大利、罗马尼亚和日本的分离株更近，而CAT1、ARA2和ARA3则与另一个土耳其分离株更近。
讨论
本研究通过RNA-Seq工作流程成功实现了对西班牙核果果园中病毒的筛查与鉴定，并确认了PPV-M毒株在首次被根除后的再度出现。测序数据质量高，de novo组装结果足以用于病毒基因组重建。病毒鉴定结果表明PPV-M在所有样本中占主导地位，同时还检测到其他多种病毒，呈现了核果作物中复杂的病毒群落。SNV分析揭示了PPV-M种群内部的遗传变异模式，高变异区域（如NIa-Pro和P1-Pro）可能与其宿主适应性相关。系统发育分析的结果表明，西班牙果园中检测到的PPV-M毒株可能存在不同的传入来源，其中一些与意大利/罗马尼亚/日本谱系相关，另一些则与土耳其谱系相关。这种聚类模式更符合近期受感染种植材料的跨国界移动，而非长期历史扩散事件，强调了当代欧洲生产体系内的交换路径。PPV-M的再现是一个严峻的问题，该毒株侵袭性强，可导致严重的叶片和果实症状，并能通过蚜虫快速传播，对阿拉贡、加泰罗尼亚和穆尔西亚等主要核果产区构成重大经济威胁。因此，研究结果凸显了加强植物检疫控制和植物种苗认证体系的重要性，以限制病毒的传播并最大限度地减少其对核果生产的负面影响。本研究获得的序列数据也将为植物病毒学界提供新的资源。
