《Separations》：HPLC-DAD Determination of Hydroquinone, Salicylic Acid, and Niacinamide in Skin-Whitening Products: Method Validation and Safety Evaluation
Khadejah D. Otaif
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这篇研究建立并验证了一种灵敏可靠的高效液相色谱-二极管阵列检测法（HPLC-DAD），用于同时测定市售及自制美白产品（SWPs）中的氢醌（HQ）、水杨酸（SAL）和烟酰胺（NIC）。该方法验证（遵循ICH Q2(R1)指南）及实际样品分析结果揭示了市场产品在成分标注与实测含量间存在显著差异，部分产品含有禁限用物质或超出安全限值，风险评估（MoS计算）显示部分产品存在不可接受的系统暴露风险。该工作为化妆品质量控制和市场监管提供了一种实用、便捷的分析方法，并揭示了无监管生产带来的安全隐患。
高效液相色谱-二极管阵列检测法（HPLC-DAD）在美白产品分析中的应用、验证与风险评估
1. 引言
皮肤美白产品（SWPs）在全球范围内被广泛使用，特别是在Fitzpatrick皮肤光分型为III-V型的地区。多项横断面研究报道了不同人群中使用SWPs的比例很高。在沙特阿拉伯，女性使用SWP的比例在2018年达到43.3%，并在近期一项研究中上升至81.4%，突显了这些产品的普遍使用以及对监测其成分和安全性的迫切需求。
皮肤美白通常涉及使用化学试剂来降低皮肤中的黑色素水平，从而减少色素沉着并使肤色变浅。这些产品既用于治疗色素沉着过度性疾病，也用于纯粹的化妆品目的。SWPs包含多种通过不同脱色机制起效的活性成分，包括酚类化合物、α-羟基酸、维生素和植物提取物。本研究重点关注氢醌、水杨酸和烟酰胺，选择它们是因为其作为皮肤美白剂的广泛使用、监管安全评估的需要，以及在SWPs中通过HPLC-DAD同时测定所带来的分析挑战。
氢醌（1,4-二羟基苯；HQ）是一种简单的酚类化合物，自20世纪60年代引入皮肤病学领域以来，一直被认为是治疗色素沉着过度的金标准。其美白作用主要归因于抑制黑色素生物合成中的关键酶——酪氨酸酶。尽管高效，HQ存在多种安全担忧，长期或不适当使用可能导致外源性褐黄病，表现为永久性的蓝黑或灰褐色皮肤变色。这些安全问题促使全球范围内实施严格的监管控制。在欧盟、美国和沙特阿拉伯，HQ在普通化妆品中均被禁止使用，仅允许在医疗监督下作为药品使用。
水杨酸（β-羟基酸；SAL）通过促进表皮更新和色素性角质形成细胞的脱落，促进深色皮肤层的逐渐去除。SAL在化妆品中的使用受到严格的浓度限制。在欧盟、美国、沙特阿拉伯等地，其在皮肤配方中的浓度被限制在最高2%（身体乳为0.5%）。更高浓度（20-30%）仅限于专业监督下的医疗化学换肤，因为高浓度可能引起局部皮肤和眼睛刺激，高暴露下甚至可能导致系统性水杨酸中毒。
烟酰胺（尼克酰胺；NIC）是维生素B3的酰胺形式，是皮肤美白配方中广泛使用且安全的成分。其主要机制是抑制黑素小体从黑素细胞向角质形成细胞的转移，从而限制色素在皮肤上层的沉积。局部使用的烟酰胺浓度最常见为2-5%。临床研究表明，4-5%的局部使用可减少色素沉着和斑点，其疗效与4%HQ相当，但副作用更少。此外，烟酰胺还具有抗炎、增强皮肤屏障功能等益处。
目前存在单独测定这些活性成分的参考方法，但对于化妆品等复杂基质，开发能够同时定量多种组分的方法至关重要。高效液相色谱（HPLC）和超高效液相色谱（UHPLC）因其高灵敏度、优异的分辨率和良好的重现性，仍然是此类分析的首选技术。据研究者所知，目前尚无经过验证的HPLC-DAD方法可用于同时测定HQ、SAL和NIC。这一局限性尤为相关，因为在许多常规质量控制实验室中，HPLC比UHPLC更易获得且成本更低。
此外，对不符合规定的市售产品和未经许可的自制美白配方流通的担忧也在增加。后者通常在线销售，没有适当的标签或任何形式的安全性评估，使消费者面临相当大的风险。因此，本研究设定了四个主要目标：开发并验证可靠的HPLC-DAD方法；将该方法应用于沙特阿拉伯市场的市售和未经许可的自制产品；检测和量化目标分析物，并评估其与监管要求的合规性；通过基于暴露的健康风险评估来评估潜在健康风险。
2. 材料与方法
2.1. 材料与试剂
研究中使用HPLC或分析级的化学品。氢醌、水杨酸、甲醇和烟酰胺购自不同供应商。使用超纯水制备流动相及标准溶液和样品溶液。制备了各分析物（1000 mg/L）的储备液，并用50%甲醇/水稀释得到校准标准品。使用市售中性亲水基质霜（O/W乳液）作为空白基质用于方法验证。
2.2. SWPs的收集与制备
从沙特阿拉伯的在线商店或个人销售的自制产品中收集了51份SWPs样品。样品根据其可用性、宣称的美白效果、宣称或怀疑含有受管制活性成分等进行选择。样品根据EN 16956:2017标准进行提取。准确称取0.5 g样品，加入50%甲醇/水的提取溶液，在60°C水浴中加热5分钟，冷却后定容并过滤。所有实际样品通过三次独立提取进行三重分析。
2.3. 仪器与色谱条件
使用岛津LC-20A HPLC系统进行分析，配备DAD检测器。使用Raptor?联苯柱进行分离。流动相由含0.01%甲酸的水（A）和甲醇（B）组成。采用梯度洗脱，流速0.5 mL/min，进样体积5 μL。柱温维持在25°C。DAD在190-400 nm范围内记录光谱，并在274 nm处提取色谱图进行定量。基于0.96-240 mg/L范围内的混合标准溶液构建六点线性校准曲线。
2.4. 方法验证
根据国际人用药品注册技术协调会（ICH）Q2(R1)指南对开发的HPLC方法进行验证。验证参数包括专属性、线性、精密度、准确度、检测限（LOD）和定量限（LOQ）。通过分析空白基质和加标空白基质样品，并与三种分析物的混合标准溶液色谱图比较来评估专属性。线性评估使用所有分析物在0.96-240 mg/L范围内的六个校准水平。通过加标空白基质在三个浓度水平进行回收率实验来确认准确度。精密度通过仪器精密度和方法精密度（重复性）来评估。LOD和LOQ通过信噪比（S/N）法估算。
2.5. 非致癌性健康风险评估
根据欧盟消费者安全科学委员会（SCCS）推荐的标准化妆品安全评估框架，评估了与皮肤暴露于含HQ和SAL的美白产品相关的非致癌性健康风险。评估包括估算系统暴露剂量（SED）、确定毒理学参考值（NOAEL）、计算安全边际（MoS）以及根据SCCS接受标准解释风险。SED根据公式SED = Eproduct× (C/100) × (DAp/100)计算，其中Eproduct为每日每公斤体重估计暴露量，C为被测配方中成分的测量浓度，DAp为实际使用条件下的皮肤吸收百分比。对于面霜，采用每次应用0.8克、每天两次的应用量。HQ和SAL的皮肤吸收因子分别采用50%和60%。毒理学参考值采用HQ的NOAEL为20 mg/kg bw/天，SAL的NOAEL为75 mg/kg bw/天。MoS计算公式为MoS = NOAEL / SED。根据SCCS标准，MoS ≥ 100表明化妆品使用的安全水平可接受，而MoS < 100则表明安全裕度不足，存在潜在健康问题。
3. 结果与讨论
3.1. 方法开发
由于SWPs通常由多种活性剂混合配制，因此开发一种可靠、简单的HPLC方法来检测和定量最常见的美白剂（禁用的HQ、限制使用的SAL、允许使用的NIC）被认为是值得的。在评估了多种固定相和流动相系统后，确立了色谱条件。初始实验表明，C18柱对HQ和NIC的保留和分离效果差。联苯柱为目标分析物提供了更有利的选择性。最终优化后的梯度洗脱程序在15分钟内实现了三种分析物的基线分离。HQ、NIC和SAL的保留时间分别为1.56、2.22和11.77分钟。
3.2. 方法验证
所开发HPLC方法的专属性通过分析不含活性成分的常用化妆品基质（空白基质）进行评估。空白基质的色谱图在三种目标分析物的保留时间处未显示干扰峰。加标空白基质样品的保留时间和UV光谱与相应标准化合物匹配，证实了峰的同一性和纯度。线性评估显示所有分析物的校准曲线相关系数R2> 0.9999。通过信噪比法确定HQ、NIC和SAL的LOD为0.2 μg/mL，LOQ为0.7 μg/mL。准确度评估显示，HQ的回收率为97.48–99.83%，NIC为99.37–101.26%，SAL为83.04–95.38%。仪器精密度和方法精密度（重复性）评估结果均令人满意，%RSD值符合要求。这些验证结果表明该方法适合用于SWPs中目标分析物的定量分析。
3.3. SWPs的特性与标签评估
分析的SWPs显示了多样化的宣称产地，中国（39.22%）和沙特阿拉伯（21.57%）占比最大。配方以霜剂为主（66.7%），15.7%的样品为本地销售的无标准化生产信息的自制产品。标签评估显示，对基本化妆品标签要求的遵守程度不一。虽然大多数产品显示了产品名称和原产国等基本信息，但只有47.06%的产品提供了INCI格式的成分列表。部分产品缺少完整的制造商信息或全成分披露，所有自制配方均无标签。关于宣称的脱色剂，27.45%的产品宣称含NIC，21.57%含SAL，17.73%含HQ。
3.4. 定量测定与宣称含量的合规性
经验证的方法应用于51份SWPs以定量HQ、SAL和NIC。结果显示，宣称的HQ含量与实测含量之间存在显著差异。尽管只有有限的市售产品宣称含有HQ，但分析检测显示其存在率略高，包括未宣称的情况。多个产品中的HQ浓度超过2%，最高达5.07%。只有一款化妆品与其标签HQ含量定量一致。虽然药品样品与分析测定的宣称浓度一致，但其非处方可获得性与监管限制不符。SAL标签不一致性更为明显。所有检测到的浓度均低于2%的监管限值，但没有一个与宣称值定量匹配。七个宣称含有SAL的产品未检测到任何含量。对于NIC，标签与分析结果之间也存在明显差异。检测频率低于宣称频率，只有一款产品与其标签含量定量一致。总体而言，NIC浓度在不同产品间差异很大。与之前报告相比，本研究中HQ的存在率与某些研究相当，但低于非洲市场。SAL的检测频率明显低于其他研究报告。NIC的检测率介于先前报道的极端值之间。这些发现反映了配方实践和监管执行的巨大地区差异。不合规情况在自制产品中尤为明显，这些产品均未列出活性成分，但经常检测到HQ和SAL。HQ被检出，SAL在某些情况下超过了2%的监管限值。NIC检测频率较低且浓度相对较低。
3.5. SWPs中活性成分的分布与共存
在商业化产品中，大多数样品含有单一活性成分，没有样品同时存在所有三种活性物。二元组合很少见，表明商业化配方通常依赖美白剂的单独使用。相比之下，自制产品显示出更复杂的混合模式，HQ、SAL和NIC频繁出现二元甚至三元组合。值得注意的是，在自制样品中从未单独检测到HQ，它总是与其他活性物组合使用。这些发现表明，与商业化生产的产品相比，无监管的制剂配方实践规范性较差。
3.6. 与所分析样品相关的监管与安全问题
标签评估揭示了所分析SWPs在合规性方面存在巨大差异。缺少或不准确的INCI成分列表阻碍了消费者的知情权，并限制了监管机构对产品安全性的核查。特别是，标签不充分可能遗漏对SAL和HQ等受管制成分的基本警告。宣称浓度与实验测量浓度之间的差异凸显了严重的标签错误和商标不当问题。几种产品的HQ或SAL浓度超过2%，引发了潜在的安全担忧。虽然根据化妆品成分评估（CIR），NIC通常被认为在高达10%的浓度下是安全的，但在样品S45中观察到的显著升高水平超过了通常研究的范围，需要安全考量。尽管有监管限制，含HQ的化妆品仍在市面销售。对欧盟安全门数据库的审查发现，在2025年1月至10月期间，有35起针对含HQ化妆品的警报，突显了持续的监管挑战。通过社交媒体频繁销售的自制样品由于缺乏质量控制和标签透明度而带来了额外的风险。研究结果揭示了未申报的活性物、非法的HQ、过量的SAL和不一致的NIC添加。在自制产品中经常观察到多成分组合。从安全角度来看，SAL-NIC等组合可能提供互补的皮肤病学益处。相比之下，HQ-SAL组合可能由于增强的HQ渗透而增加刺激和炎症后色素沉着过度，使得该组合不适合常规化妆品使用。
3.7. 健康风险评估
SED和MoS计算清楚地区分了市售和自制产品中具有可接受和不可接受安全边际的配方。对于含HQ的产品，一些自制产品和所有市售产品在保守的每日两次暴露场景下，MoS值均低于SCCS安全阈值100，表明系统安全边际不足。还进行了假设每日一次应用的敏感性分析。虽然MoS值翻倍，但五个含HQ样品的安全边际仍然不足，表明安全边际不足主要是浓度依赖性的，而不仅仅是暴露频率假设所致。相比之下，含SAL的产品通常在保守的每日两次暴露场景下表现出远高于100的MoS值，表明系统性问题较低，尽管在某些样品中观察到了与浓度相关的监管不合规。这些发现与之前的评估报告一致。对于自制产品，由于缺乏正式的标签、使用说明和宣称的成分信息，限制了产品特定暴露数据的可获得性。尽管如此，由于这些产品是作为面部美白霜销售的，因此应用了标准化的RIVM/SCCS筛选级面部暴露场景，以确保方法学的一致性和可比性。这代表了在标签不完整条件下的保守默认假设。总之，结果强调了持续监管监测和提高消费者对市售SWPs系统安全性认识的重要性。
4. 结论
这项研究证实了所开发的HPLC-DAD方法适用于同时测定各种化妆品基质中的氢醌、水杨酸和烟酰胺。经验证的方法显示出可靠的分析性能，并成功应用于51种市售和自制SWPs的多样化样品分析。分析结果揭示了所宣称成分与测量含量之间的显著差异，以及监管不合规的情况，特别是在自制产品中。风险评估突显了与使用某些含HQ产品相关的潜在健康问题。总体而言，该研究为SWPs的常规质量控制、市场监管和消费者安全保护提供了一种实用且易获得的分析工具。
